来 源：刘天乐，朱田田，张明惠，张 菁，徐 丽，康舒淇，晋 玲．当归活性成分生物合成与调控研究进展 [J]. 中草药, 2023, 54(22): 7545-7554.
药用植物的生长发育常受病虫害及各种非生物胁迫的影响，导致其面临活性成分含量低、资源匮乏等问题[1]。近年来，有大量研究通过组学技术、分子生物学技术、合成生物学技术、人工智能等[2]手段对药用植物活性成分的生物合成途径进行解析。黄花蒿中青蒿素、丹参中丹参酮和丹酚酸、红豆杉属中紫杉醇、长春花中长春碱和长春新碱及人参属中人参皂苷等活性成分的生物合成转录调控途径已较为清晰[3]，通过对这些途径中相关基因的上调或下调，可增加其活性成分的合成和积累。
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根，是我国常用大宗药材，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等重要功效[4]。随着提取与检测技术的不断发展，已从当归中分离鉴定出165多种化学成分[5]，其中酚酸类、黄酮类、香豆素类、多糖类及苯酞类等化合物是当归中重要的活性成分，与其功效密切相关[6-7]。甘肃所产当归品质好且质量稳定，但由于产区局限、野生资源极少、生长过程中早期抽薹严重等，阻碍了当归的品质提升和开发利用[8-9]。因此，本文对当归中已解析的活性成分生物合成途径、调控机制及相关功能基因进行综述，并对活性成分合成和积累的影响因素进行总结，为当归的品质提升、品种改良和精准栽培提供理论基础。
1 当归活性成分的生物合成途径及相关基因
1.1 酚酸类成分
酚酸类成分是当归中的主要活性成分之一，包括阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸松柏酯、阿魏醛等[6]。阿魏酸是《中国药典》2020年版当归质量控制的指标成分[4]，绿原酸是当归发挥抗炎作用的关键质量标志物之一[10]，因此对这2种酚酸类成分的生物合成进行总结。
1.1.1 阿魏酸
阿魏酸是苯丙烷类代谢途径中的产物之一，具有抗氧化、抗血栓、调节血脂、降低心肌缺血和耗氧量、抗菌、抗病毒、抗癌等作用[11]。苯丙烷代谢是植物体内最重要的代谢途径之一，对植物生长发育和逆境胁迫应答具有重要作用，并且与药用植物中许多活性成分的合成密切相关。苯丙烷代谢途径中前3步的催化反应被认为是整个代谢途径的核心反应[12]，包括苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸-CoA连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）。
此外，羟基肉桂酰基转移酶（hydroxycinnamoyl transferase，HCT）、肉桂酰辅酶A还原酶（cinnamoyl- CoA reductase，CCR）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl- alcohol dchydrogenase，CAD）、查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）、查耳酮异构化酶（chalcone isomerase，CHI）、对香豆酸-3-羟基化酶（coumarate- 3-hydroxylase，C3H）及黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）、类黄酮3′-羟化酶（flavonoid 3′-hydroxylase，F3′H）、F3′5′H等催化酶也在苯丙烷类代谢途径中发挥重要作用。
在当归中，阿魏酸通过咖啡酸-O-甲基转移酶（caffeic acid-O- methyltransferase，COMT）途径和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（caffeoyl CoA-O-methyltransferase，CCoAOMT）途径进行合成与积累[13]。COMT途径可产生咖啡酸和阿魏酸等活性物质，而CCoAOMT途径则主要产生松伯醛、木脂素等无药理活性成分[14]（图1）。在CCoAOMT途径中，木脂素合成位于阿魏酸下游，通过调控该途径上的相关基因达到在提高阿魏酸含量的同时降低木脂素含量的效果[13]。
当归中的AsPAL[15-16]、As4CL[17]、AsC3H[18]、AsCOMT[19-21]等关键酶基因已被成功克隆和表达分析。采用转录组和代谢组学的联合分析对当归头部与尾部的差异表达基因和差异代谢物进行对比，发现当归尾部阿魏酸的平均含量显著高于头部，且PAL、CAD、COMT和过氧化物酶等酶基因的表达量也更高[22]，以上结果进一步证实了当归中阿魏酸含量与AsPAL、AsCOMT等酶基因存在密切关系。
苯丙烷代谢途径除受直接编码与苯丙烷类生物合成有关的酶基因控制，还受包括转录因子在内的一系列调节基因控制，如MYB类转录因子的表达会对苯丙烷代谢途径产物的生成与积累产生影响[23]。AsMYB4[24]和AsMYB44[25]可能参与调控当归阿魏酸的生物合成与积累。AsMYB44可能通过调控苯丙烷代谢途径中PAL、C4H、4CL、COMT、CAD等基因的表达量[25]，进而正向调控酚酸类成分的合成与代谢。当前，对当归阿魏酸生物合成途径中关键酶基因的研究较多，而对途径中相关转录因子功能的报道较少，需进一步研究转录因子对该途径的调控。
1.1.2 绿原酸
绿原酸是当归的有效成分之一，也是当归苯丙烷类代谢途径的产物之一[13]，具有心血管保护、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调脂降糖、免疫调节、抗紫外及抗辐射等药理作用[26]。目前，在植物中存在3条具有争议的绿原酸生物合成途径，其中羟基桂皮酰辅酶A羟基桂皮酰转移酶（hydroxycinnamoyl CoA quinate hydrocycinnamoyl transferase，HQT）、HCT、C3H等是这些途径中的关键酶[27]。（1）由HQT催化奎宁酸和咖啡酰CoA生成绿原酸；（2）绿原酸来自奎宁酸和咖啡酰-D-葡萄糖，并由羟基肉桂酰基葡萄糖催化；（3）绿原酸来自对香豆酰奎宁酸，并由羟基肉桂酰CoA莽草酸/奎宁羟基肉桂酰转移酶催化而成。其中，第1条生成绿原酸的途径被认为是最主要的合成途径[28-29]。
绿原酸是金银花的标志性成分，近年来对金银花中绿原酸的生物合成研究已有较大进展。其中，4CL、C3H、HCT、HQT等酶基因，及碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）蛋白和MYB转录因子，与金银花绿原酸生物合成密切相关[30]。目前尚未见调控当归绿原酸生物合成途径的相关基因或转录因子报道，可结合金银花已发表研究成果对当归该途径进行深入研究。
1.2 黄酮类成分
黄酮类成分是当归中的1类重要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、改善糖脂代谢等作用，目前已从当归中分离出3个查耳酮衍生物和2个黄酮苷[31]。黄酮类成分在植物生长发育和生态防御中也具有重要作用，如影响植物花色、负向调节生长素运输、调节种子萌发、根系生长及光合色素合成等；在遭遇胁迫时黄酮类成分大量积累，能提高植物对逆境胁迫的耐性和抗性[32]。
在黄酮类成分的合成途径中，苯丙氨酸通过PAL、C4H、4CL这3个关键酶转化为对香豆酰CoA。CHS是将苯丙烷代谢途径引向黄酮类成分合成的关键酶和限速酶。在CHS催化香豆酰CoA反应合成柚皮素查耳酮后，CHI可进一步催化柚皮素查耳酮合成柚皮素[32-34]，见图1。
Zhu等[35]对当归中黄酮类成分生物合成相关基因进行了报道，认为紫茎当归（‘岷归1号’）的黄酮类含量显著高于绿茎当归（‘岷归2号’）。在对2个品种当归黄酮类成分生物合成途径差异机制的研究中发现，参与其黄酮类成分生物合成的差异表达基因包括CHS1、CHI3、FHT、二氢黄酮醇-4-还原酶（
dihydroflavonol-4-reductase，DFR）、F3GT1、UGT73C6、ANS、3MAT8等[36]。该研究进一步验证了CHS、CHI在当归黄酮类成分生物合成过程中具有重要作用。
在转录水平上，黄酮类成分生物合成途径主要受MYB、bHLH和WD40等转录因子的调控[37]，且以上转录因子形成的MYB-bHLH-WD40复合物能够参与植物中的的茉莉酸信号通路，通过调控下游基因的表达进而影响植物次生代谢物的合成。CHS基因的表达同样受MYB、bHLH、WD40及bZIP等转录因子的调控[38]。在对紫茎当归和绿茎当归的研究中也提到，参与其黄酮类生物合成的差异表达基因包括MYB90、MYB114等[35]。目前尚未见有关当归转录因子MYB90和MYB114功能的研究报道，但在其他药用植物的基因功能研究中已有报道。
在对白杨树的研究中发现，PalbHLH1和PalMYB90的过表达能够增强黄酮类生物合成途径中次生代谢物的积累和抗氧化酶的活性，进而增强白杨树对病原菌感染的抗性[39]。在紫花苜蓿中[40]，过量表达的MtMYB114基因能够对黄酮类化合物合成途径中的DFR基因起正调控作用，使DFR的基因表达量增加。这些结果为MYB90和MYB114参与当归黄酮类生物合成调控提供了研究思路。
1.3 香豆素类成分
香豆素类成分是当归的化学成分之一，包括花椒毒素、异欧前胡素、欧前胡素、珊瑚菜素、氧化前胡素、花椒毒醇等[41]，该类化合物对生长细胞具有促凋亡作用，可显著抑制肿瘤细胞增生，还具有抗抑郁、抗心律失常、降低心肌收缩力等作用[42]。部分香豆素类成分的生物合成途径已有研究报道，如伞形酮、东莨菪内酯、花椒毒素等，其生物合成过程是先由葡萄糖反应生成莽草酸，莽草酸再在分支酸途径下生成苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸，苯丙氨酸可在PAL的作用下生成香豆素类成分的起始物质肉桂酸[43]。
Han等[44]通过对当归基因组、转录组及代谢组的多组学联合分析，筛选出当归中简单香豆素合成和调控的关键基因，并绘制出当归简单香豆素合成途径，见图1。该研究鉴定出了81个可能参与简单香豆素生物合成的酶基因，包括了C4H、C3H、4CL、HCT、COMT、CCoAOMT、香豆素合酶基因及阿魏酰CoA-6′-羟化酶（feruloyl-CoA- 6′-hydroxylase，F6′H）基因等，并且计算了这些基因表达水平与伞形酮、秦皮乙素、东莨菪内酯、阿魏酸4种代谢物含量的相关系数，为研究当归香豆素类成分生物合成相关基因的功能验证奠定了基础。
1.4 其他类成分
1.4.1 当归多糖（angelica polysaccharide，APS）
APS是当归主要活性物质之一，具有抗氧化、抗炎镇痛、抗辐射、增强免疫、抗心肌缺血、抗肿瘤、延缓衰老等药用价值[45]，近年来其在缓解糖尿病并发症[46]、抗运动疲劳[47]等方面的作用受到越来越多关注。通过对APS类化学成分的分析和鉴定[48]，发现ASP是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖和半乳糖醛酸等组成的杂多糖。
由于多糖结构的复杂多样性，目前对植物多糖的研究主要集中在多糖提取工艺、结构解析、药理作用等方面，而对多糖生物合成通路研究相对较少。植物中多糖的生物合成途径主要包括3个步骤[49]。
（1）蔗糖经过一系列转化生成尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖、鸟苷二磷酸甘露糖（guanosine diphosphate mannose，GDP）-甘露糖和GDP-岩藻糖；（2）UDP-葡萄糖转化为其他二磷酸核苷单糖；（3）通过不同的糖基转移酶将单糖从糖核苷酸供体结合到生长中的多糖聚合物中，随后这些重复单元被聚合和输出，形成植物多糖。其中关键酶包括蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖转化酶（invertase，INV）、己糖激酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase）、磷酸甘露糖突变酶、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶（UDP-glucose-4-epimerase，UGE）等。从APS的组成来看，INV、UGE、UGPase可能是ASP生物合成途径中的关键酶。
在铁皮石斛多糖合成途径的相关研究表明，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosp hate dehydrogenase，GAPDH）基因适合作为内参基因，用于其多糖合成相关基因在不同组织中和低温胁迫处理下基因表达的差异分析[50]。在对当归GAPDH的组织表达研究中[51]，发现AsGAPDH基因在当归根、叶柄、叶中的表达水平基本一致，且表达较稳定。因此，AsGAPDH可能对APS的生物合成研究具有重要意义。
1.4.2 苯酞类化合物
苯酞类化合物作为当归挥发油的重要组成部分，具有平喘、抗肿瘤、抗血小板聚集等药理作用。已从当归提取物中鉴定出Z-藁本内酯、E-藁本内酯、正丁基苯酞、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯G、洋川芎内酯A、洋川芎内酯J、川芎内酯等55个苯酞类化合物[52]，可分为简单苯酞、苯酞二聚体和三聚苯酞[53-54]，其中藁本内酯含量最高。有研究表明，在当归不同生长期中，藁本内酯可转化成洋川芎内酯A、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、欧当归内酯A、正丁基苯酞5个化学成分，但藁本内酯含量远远大于转化产物的含量，说明藁本内酯是苯酞类化合物的核心成分[55]。此外，丁苯酞和藁本内酯还具有杀虫活性[56]，与传统杀虫药相比更加安全且对环境造成污染较小。
苯酞类化合物不稳定，易受光照和温度等因素的影响而发生转化，导致该类化合物结构多样[57]，增加了苯酞类化合物合成的研究难度。目前对当归苯酞类化合物生物合成途径的认知仍存在很多空白，大量的催化酶类及代谢底物和产物仍有待发现。有研究表明，磷酸2-脱氢-3-脱氧庚酮醛缩酶2、莽草酸脱氢酶、类伯胺氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸脱羧酶、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶6种酶可能参与苯酞类化合物的生物合成途径[58]。
目前，已对部分参与当归活性成分生物合成的功能基因或调控基因进行了克隆，对这些基因进行了归纳总结（表1）。
2 当归重要活性成分合成和积累的调控因素
2.1 早期抽薹
早期抽薹严重制约当归药材的生产。与正常生长的当归相比，早薹开花的当归中阿魏酸、黄酮类、多糖类等活性成分的含量显著降低，木脂素含量增加并诱导当归根木质化，使当归无法入药，进而丧失药用价值[64]。在早薹开花影响当归重要活性成分代谢的研究中发现有一些基因参与调控，如在当归抽薹植株中，参与阿魏酸生物合成途径的PAL1、C3H、COMT1、4CL5、4CL9、HCT、CCOMT和CCR1等基因的表达量增加，而4CL4和4CL7的表达量减少；参与黄酮类生物合成途径的CHI、CHS、I3′H、GT6等基因表达量则呈现先增加后减少的趋势，这与黄酮类化合物积累量的变化一致[65-66]。
此外，一些参与促进或抑制当归开花的关键基因也十分值得关注，如FT（flowering locus T）、SOC1（suppressor of overexpression of constans 1）、FLC（flowering locus C）、LFY（LEAFY）、部分赤霉素代谢基因[67-68]及与当归开花相关的长链非编码RNAs[69]等，通过调控这些基因可有效抑制当归的抽薹开花。通过有效手段[70]控制当归早期抽薹能够使其活性成分正常代谢，达到提高当归的产量与质量的目的。
2.2 生境条件
2.2.1 海拔高度
光照、温度、水分等往往随海拔高度变化而变化，而当归活性成分的代谢与海拔高度密切相关，如在2294～2624 m的海拔，当归中阿魏酸含量随海拔升高呈上升趋势[71]。在当归栽培过程中，适当降低光照强度[72]、降低温度[73]或增加水分[74]，都有利于提高当归的阿魏酸含量。
适当的遮阳栽培能显著提高当归产量和单株鲜重、降低麻口病感病率，并能有效降低当归抽薹[75]，从而改善当归品质。在增强紫外线-B的胁迫下[76]，发现绿茎当归中阿魏酸和黄酮类化合物的积累增加，而紫茎当归对该胁迫的抗性较差。该研究根据2品种当归的差异基因表达量进行分析，推测其内在原因为：绿茎当归中参与黄酮类生物合成的DRF和CHS表达显著上调，且参与阿魏酸生物合成的相关酶基因表达多数上调，增加的黄酮类化合物提升了绿茎当归对紫外线-B的抵抗力；而紫茎当归中的4CL、CCR和COMT的表达下调，不利于阿魏酸的积累。此外，当归延伸因子-1β（elongation factor-1β，EF-1β）基因也可能参与当归对紫外线-B胁迫的适应过程[60]。
在低温胁迫下，植物能够合成更多的黄酮类、酚酸类化合物，进而提高植物抗寒性，避免保护植物细胞受到伤害[77-78]。适当的低温条件比常温更有利于当归的生长并能够促进阿魏酸、黄酮类等活性成分的积累，这可能是由于阿魏酸生物合成相关基因（PAL1、4CLL4、4CLL9、C3H、HCT、CCOMT、CCR）及黄酮类生物合成相关基因（CHS、CHI）的表达上调引起的[79]。
水分是植物正常生长发育的必要条件和重要限制性因素[80]，但近年全球气候变暖日趋严重，导致越来越多的研究关注到干旱对植物的影响。干旱影响当归活性成分生物合成的分子机制研究还较少，因此需在干旱胁迫基础上对当归基因进行深入挖掘。
2.2.2 土壤条件
不同的土壤中所含的营养元素、化学元素及微生物种类各不相同，均会对当归重要活性成分的代谢产生影响。如施用氮、磷化肥均会促进当归提前转入生殖生长阶段，加速抽薹进程[81]；随着镁螯合肥喷施浓度（螯合镁含量≥5.8%，稀释倍数为400、800、1200、1600）增加，阿魏酸、藁本内酯含量会呈先升后降的趋势[82]；用含K+ 6.0 mmol/L的营养液浇灌处理当归后，可促进当归中COMT、4CL、阿魏酸-5-羟化酶（ferulate-5-hydroxylase，F5H）基因的表达，这可能会对当归幼苗的生长和阿魏酸的积累产生影响[83]；施用钾素（300 kg K2O/hm2）能够促进当归阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、欧当归内酯A、洋川芎内酯的合成[84]；喷施氯化稀土微肥0.8 g/mL和硝酸稀土微肥1.2 g/mL可提高当归根对氮、磷、钾等营养元素和水分的吸收，并增加阿魏酸、藁本内酯的含量[85]。
此外，对当归叶面喷施一定浓度的纳米铁，能够提高茉莉酸、细胞分裂素水平，降低水杨酸、脱落酸、生长素水平，促进当归药效成分阿魏酸、Z-藁本内酯、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A的生物合成[86]。
当归重要活性成分的代谢也受到一些土壤微生物的的影响。与云南产区相比，当归道地产区甘肃的土壤中含有大量有益于当归生长发育的细菌，如鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属Pseudomonas、溶杆菌属Lysobacter、假黄色单胞菌属Pseudox anthomonas等，并且藁本内酯二聚体的含量与副黄假单胞菌Pseudomonas parafulva相对丰度呈显著正相关[87]。有研究表明，当归幼苗期根际微生物以变形杆菌为主，与酚酸类化合物的生物合成关联性较强，而成药期根际微生物以放线菌（Actinobacteria）为主，与苯酞类、黄酮类、胺类、脂肪酸类等化合物生物合成关联性较强。
另外，该研究还发现节杆菌（Arthrobacter）与洋川芎内酯A、正丁烯基苯酞的积累、JGI 0001001.H03与绿原酸的积累都有很强的相关性[88]。此外，添加内生真菌后，当归中Z-藁本内酯和阿魏酸的含量均呈现出明显的增加趋势，但添加内生放线菌或细菌后，Z-藁本内酯和阿魏酸的含量则呈现出抑制趋势[89]。因此，在当归的种植过程中，合理施加有机肥、生物菌肥，不仅可以促进当归生长，还能够增加有效活性成分的合成和积累，有利于当归品质的提升。
3 结语与展望
目前，当归酚酸类、黄酮类及香豆素类活性成分的生物合成途径已较为清晰，但途径中许多关键基因的研究仍片面的集中于独立的克隆、表达及对环境因素的响应，缺乏整体性和系统性的研究，其调控机制也有待进一步阐明。而APS类和苯酞类活性成分则由于物质结构复杂多样或不稳定等因素，其在当归中的研究还较少，仍缺乏对途径中关键基因的挖掘和功能分析。当归重要活性成分合成和积累的调控因素主要包括了早期抽薹和生境条件，这些因素会使活性成分生物合成途径中的基因表达上调或下调，进而影响当归中活性成分的含量。明确调控活性成分合成和积累的关键基因与因素的关系，对当归的实际生产、栽培具有重要意义。
中药合成生物学是在合成生物学基础上，设计并构建合成药用植物功效成分的细胞工厂，可用以生产植物天然产物的新学科，为中药活性成分提供更高效且稳定的生产方式，帮助解决传统的天然提取和人工化学合成的方法难以满足现代可持续发展的矛盾。因此，解析当归重要活性成分的生物合成途径不仅能够为当归的品质调控、品质改良等研究奠定基础，还能够为构建细胞工厂实现批量生产酚酸类、黄酮类、香豆素类、多糖类及苯酞类等活性成分提供理论依据。
