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一种基于VIGS体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法

来源：花匠小妙招时间：2025-08-11 20:39

本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法。

背景技术：

1、随着人民生活水平的提升，农业市场对花卉的需求量日益增长。目前我国的球根花卉市场面临着商品种球供需不平衡、质量参差不齐，球根花卉来源严重依赖进口的问题。我国石蒜属(lycoris spp.)植物种质资源丰富，占全球石蒜属植物资源的80％以上，是该属植物的自然分布中心。换锦花(lycoris sprengeri)为石蒜科(amaryllidaceae)石蒜属(lycoris)多年生球根花卉，换锦花花型优雅，花色在粉色与蓝色之间变化极为丰富，花期正值少花的夏末秋初，鳞茎还可以用于提取加兰他敏，是一种极具开发利用价值的中国原产观赏植物。换锦花的商品化存在着鳞茎膨大速率慢、发育周期长，鳞茎繁殖效率低等问题，且花卉市场上的换锦花来源还以采挖野生资源为主，对换锦花的自然资源也造成了巨大的破坏。阐明调控换锦花小鳞茎发生的分子机制，对于提高换锦花小鳞茎繁殖系数、加快种球产业化进程、保护换锦花野生资源具有重要意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明公开了一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，包括以下步骤：(1)lscwin2基因沉默载体构建；(2)基因沉默载体转化农杆菌并侵染烟草验证载体构建成功；(3)农杆菌介导基因沉默载体转化换锦花鳞茎。

4、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述(1)lscwin2基因沉默载体构建包括以下步骤：

5、(11)获得目的基因lscwin2保守区域的cds片段；

6、(12)把cds片段整合到ptrv2-gfp载体上得到重组产物ptrv2-lscwin2-gfp；

7、(13)将重组产物ptrv2-lscwin2-gfp转入dh5α感受态大肠杆菌。

8、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述cds片段如seq id no.3所示。

9、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述步骤(11)包括以下步骤：提取换锦花鳞茎的rna并反转录为cdna，根据ptrv2-gfp载体的酶切位点和lscwin2保守序列设计特异性引物，扩增出目的基因lscwin2保守区域的cds片段。

10、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述(2)重组质粒转化农杆菌并侵染烟草包括以下步骤：

11、(21)用冻融法将ptrv2-lscwin2-gfp重组质粒转入农杆菌gv3101，培养得ptrv2-lscwin2-gfp菌液，同理获得ptrv1菌液，在上述菌液中加入等体积侵染液，暗培养3h；

12、(22)ptrv2-lscwin2-gfp菌液与ptrv1菌液按体积比1：1混合，将混合好的菌液注射至本氏烟草的叶肉细胞中，并做好注射范围的标记，每株注射注射2～3个叶片，24℃暗培养2天后观察表型，若有绿色荧光产生即可证明基因沉默载体构建成功。

13、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述(3)农杆菌介导载体转化换锦花鳞茎包括以下步骤：

14、(31)换锦花鳞茎清洗干净后去除须根和叶片，浸泡在超纯水中，将鳞茎从基盘纵向切割成四等份，切好的球根放入多菌灵溶液中杀菌，再用超纯水清洗后取出放入干净的烧杯中备用；

15、(32)ptrv1菌液和ptrv2-lscwin2-gfp菌液培养至od600值在1.0～1.5时停止摇菌，在上述菌液中加入等体积侵染液，暗培养3h；

16、(33)将ptrv1菌液和ptrv2-lscwin2-gfp菌液等体积混合，晃匀后浸没烧杯中的换锦花鳞茎，将其放入真空泵中，-0.9kg/cm2条件下抽真空30～40min，缓慢放气20min；

17、(34)处理后将换锦花取出，不重叠地排列放置在铺装着灭菌处理过的湿润纱布的搪瓷盘上，排列好后在鳞茎上覆盖上同样的纱布，24℃暗培养，每天喷施多菌灵溶液和超纯水，保持90～95％的湿度，以保证鳞茎所需的气培环境，直到形成新的小鳞茎。

18、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述步骤(33)中换锦花鳞茎直径超过3cm。

19、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述步骤(33)气培之前还需低温冷藏。

20、进一步的，上述一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，所述侵染液含有含10mm mgcl2，10mm mes和200μm as。

21、本发明具有以下有益效果：

22、本发明明确了lscwin2基因是换锦花小鳞茎发生的重要基因，该基因编码细胞壁蔗糖转化酶，细胞壁蔗糖转化酶(cell wall invertase，cwin)是蔗糖质外体卸载途径中的关键酶，通过水解蔗糖为葡萄糖和果糖以提供库器官生长发育所需的能量和信号。

23、对于球根花卉而言，利用种球进行无性繁殖是生产中最常用的繁殖方式。目前，对于石蒜属植物换锦花的鳞茎膨大过程以及小鳞茎发生过程机理研究尚不透彻。本发明以换锦花鳞茎为研究对象，通过对换锦花小鳞茎发生过程中的关键基因lscwin2进行基因沉默来进行功能研究。本发明提供了通过降低lscwin2基因的表达抑制换锦花小鳞茎发生方面的应用，为培育繁殖率高的转基因换锦花奠定了研究基础，具有较高的应用价值。

技术特征：

1.一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)lscwin2基因沉默载体构建；(2)基因沉默载体转化农杆菌并侵染烟草验证载体构建成功；(3)农杆菌介导基因沉默载体转化换锦花鳞茎。

2.根据权利要求1所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述(1)lscwin2基因沉默载体构建包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述cds片段如seq id no.3所示。

4.根据权利要求2所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述步骤(11)包括以下步骤：提取换锦花鳞茎的rna并反转录为cdna，根据ptrv2-gfp载体的酶切位点和lscwin2保守序列设计特异性引物，扩增出目的基因lscwin2保守区域的cds片段。

5.根据权利要求2所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述(2)重组质粒转化农杆菌并侵染烟草包括以下步骤：

6.根据权利要求2所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述(3)农杆菌介导载体转化换锦花鳞茎包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述步骤(33)中换锦花鳞茎直径超过3cm。

8.根据权利要求6所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述步骤(33)气培之前还需低温冷藏。

9.根据权利要求5或6所述的一种基于vigs体系构建的换锦花鳞茎中的基因沉默方法，其特征在于，所述侵染液含有含10mm mgcl2，10mm mes和200μm as。

技术总结
本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种基于VIGS体系构建的换锦花鳞茎基因沉默方法，包括以下步骤：(1)LsCWIN2基因沉默载体构建；(2)基因沉默载体转化农杆菌并侵染烟草验证载体构建成功；(3)农杆菌介导基因沉默载体转化换锦花鳞茎；本发明以换锦花鳞茎为研究对象，通过对换锦花小鳞茎发生过程中的关键基因LsCWIN2进行基因沉默来进行功能研究。本发明提供了通过降低LsCWIN2基因的表达抑制换锦花小鳞茎发生方面的应用，为培育繁殖率高的转基因换锦花奠定了研究基础，具有较高的应用价值。

技术研发人员：刘悦,夏宜平,任梓铭,肖潇,李晓东
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/7/9