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一种利用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季花色调控基因的方法

来源：花匠小妙招时间：2025-05-09 19:24

本发明属于植物基因工程，具体涉及一种利用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季花色调控基因的方法。

背景技术：

1、月季(rosa rugosa thunb.)是蔷薇科蔷薇属多年生藤本或灌木，花香宜人，花色绚丽，被称为花中皇后，是我国古老的十大名花之一。经过200多年的选育，现代月季已有35000多个品种，在切花及园艺栽培中广泛应用。

2、月季是世界“四大切花”之首，在观赏植物中具有重要的地位，其花香、花色、花型都是重要的园艺观赏性状，对这些性状的改良也一直是育种工作者们的育种目标。然而目前关于月季的转基因体系尚不成熟，严重阻碍了对月季生长发育代谢相关分子机制的深入研究，尤其是花色和香气以及花器官次生代谢相关，需要一定时间的营养积累期才能实现，传统方法对其表型鉴定的周期过于冗长。

3、目前，月季的转基因体系主要有稳定转化和瞬时转化两种方法。关于稳定转化方法申请共开和授权的相关专利主要有利用芽点(公开号cn103146748a)和体细胞胚(公开号cn102220372b)两种，操作步骤繁琐复杂，且受限于芽点、体细胞胚等转化受体材料(难以大规模获取)，且转化效率低、生长周期长。

4、瞬时转化主要为vigs介导的基因沉默方式，侵染手法有月季组培苗-真空渗透转化法(公开号cn108611353a)和月季枝条-真空渗透转化-嫁接/扦插法(公开号号cn108611353a)，前者利用月季已经生根的组培苗进行真空渗透实现转化，但这种方法需要提前预备大量无菌月季组培苗，一方面前期组培苗的生长和维护成本较高，且有一定技术门槛；另一方面组培苗大多是幼嫩的小苗，比较适用于月季生长发育或胁迫响应方面基因功能的研究，而针对花器官代谢花香花色方面相关的基因功能研究仍受限于漫长的生长周期(不定芽真空渗透沉默的窗口期短，不利于研究花器官的花色花香性状)。并且操作过程中需要严格保持无菌环境，侵染后组培苗接种于新的生根培养基，步骤繁琐复杂，降低了成功率。而第二种月季枝条真空渗透-扦插的方法，相比而言材料较为容易获得，但抽真空后需要将枝条进行扦插，成功扦插成活有一定技术难度，存在一个扦插成活率的问题。与第一种方法类似，这种侵染方式也比较适用于植株生长发育和胁迫响应方面基因功能的研究，扦插苗成活后生长发育到开花需要漫长的生长周期，对于研究花香花色相关的基因功能而言相对困难，漫长的等待也难以确保vigs的沉默效率。枝条真空渗透转化-嫁接/扦插法需要经历接穗或扦插苗恢复生长的过程，实验周期漫长，不利于花器官相关性状研究。

5、为了克服现有的月季瞬时转化方法的弊端，急需创建以病毒诱导的基因沉默体系为媒介，以未绽开的月季花器官为转化材料，结合注射技术的基因瞬时转化方法，以实现对月季花器官花色、花香等重要性状的调控基因的功能鉴定

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种利用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季花器官中基因功能的瞬时转化方法，该方法操作简单、材料易得、表型鉴定周期短、转化效率高，有利于实现对花器官特异性基因功能的大规模验证。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种用于利用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季花色调控基因的重组病毒质粒，所述重组病毒质粒为pnc-trv2：dfr，所述重组病毒质粒包含dfr基因，载体为pnc-trv2载体，所述dfr基因序列如seq id no.1所示。

3、一种花青素合成调控基因dfr片段，其同源核苷酸序列登录号为kf734592.1。具体是将上述的dfr基因片段作为干扰片段，构建基于烟草脆裂病毒的基因沉默载体，所述载体转化目标植株后，可干扰目标植株内源dfr基因的表达，使植株内源dfr基因发生沉默。

4、一种利用病毒诱导的基因沉默体系鉴定月季花色调控基因的方法，所述方法包括以下步骤：

5、s1构建重组病毒质粒pnc-trv2：dfr；

6、s2利用所述重组病毒质粒pnc-trv2：dfr通过液氮冻融法转化农杆菌gv3101，同时转化ptrv1和pnc-trv2空载体，将含有载体质粒的农杆菌菌液，按照1：1混合，制备侵染液；

7、s3将所述侵染液避光室温静置活化4h后，使用注射花蕾期萼片的方法侵染月季花器官；

8、s4将所述步骤s3中侵染后的月季植株置于培养箱中常规培养。

9、优选的，所述s1中构建重组病毒质粒pnc-trv2：dfr的方法为：

10、s1-1、通过人工合成获得dfr干扰片段376bp，两侧含有nc接头序列，如seq idno.1所示；

11、s1-2、通过同源重组方式将dfr干扰片段插入到pnc-trv2载体的克隆框中，转化transt1大肠杆菌感受态，涂布培养，挑选阳性单克隆，获得的重组病毒质粒pnc-trv2：dfr。

12、优选的，所述s2中制备侵染液的过程为：将pnc-trv2：dfr及ptrv1质粒使用液氮冻融的方法转化农杆菌感受态gv3101，分别挑取阳性单克隆于lb液体培养基中获得阳性菌液，转入50ml yeb液体培养基中培养过夜，od600＝0.8，收集菌体并利用重悬液重悬至od600＝0.5，将ptrv1重悬液与pnc-trv2：dfr重悬液1：1混合，避光温室静置活化4h后，得到侵染液。

13、优选的，所述s3中注射花蕾期萼片的方法为：使用1ml注射器进行侵染，利用针头在未露色花蕾期的萼片上挑出伤口，将侵染液在的萼片上进行注射，直到注射部位浸润出水渍状，用无菌水冲洗干净。

14、优选的，所述s4中培养的具体步骤为：侵染后的月季植株置于培养箱中暗培养24h；在25℃，光照10000lux，每天光照16小时，黑暗18℃，8h的培养条件下培养2-3周出现表型。

15、优选的，所述50ml yeb液体培养基含有50mg/l的卡那霉素、25mg/l利福平、200μmas、10mm mes。

16、优选的，所述重悬液含有200μm as、10mm mes、10mm mgcl2。

17、含有dfr基因片段的重组病毒质粒和转基因工程菌在快递鉴定月季花青素合成调控基因dfr功能中的应用。

18、本发明具有以下有益效果：(1)本发明构建了烟草脆裂病毒trv介导花色调控相关的目的基因沉默载体，并转化农杆菌，通过对月季的花器官进行瞬时转化，诱导了目标基因的沉默，抑制了花器官中的花青素合成；通过注射花蕾期萼片可以很好地克服现有技术中存在的弊端，针对性的优化了花器官发育或花香花色性状相关基因功能的vigs沉默体系，材料更加容易获得，避免了组培苗养护和扦插等植株恢复生长的过程，只需要带花蕾的普通盆栽月季即可；操作简单，注射花蕾期萼片，不损伤花瓣，无需无菌操作以及后续扦插嫁接等复杂流程；注射后两周左右花朵开放即可观察表型并进行基因功能鉴定，免去了等待漫长的开花结果等生命过程。该侵染方法在局部器官基因功能的研究上优势明显，具有操作简单、材料易得、出现表型周期短(2-3周)等优势，解决了传统利用组培苗、枝条扦插等步骤繁琐、实验周期长的问题；提高了vigs在月季的花器官中的应用效率，为大规模开展快速鉴定月季花色调控基因提供了有效工具。

19、(2)本发明以带有未露色花蕾的月季为材料，简单易得；相比现有的月季抽真空扦插，组培苗抽真空等vigs体系，本方法具有通量高、成本低、操作简单、效率高、周期短等优势，为了克服现有的月季瞬时转化方法的弊端，以实现对月季花器官花色、花香等重要性状的调控基因的功能鉴定。