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鉴定牡丹花芽内休眠解除相关基因功能的方法及基因PsmiR172b应用

来源：花匠小妙招时间：2025-07-08 10:05

本发明属植物基因工程，涉及一种鉴定牡丹花芽内休眠解除相关基因功能的方法及基因应用。

背景技术：

1、牡丹(paeonia suffruticosa andr.)是原产中国的特有名贵花卉，也是重要的油用和药用植物，在花卉产业中占有重要地位。无论作为观赏还是油用栽培，开花都是实现其经济价值的保障，而解除内休眠是保证顺利开花的前提。春节催花是牡丹产业的主要内容之一，提前解除花芽休眠是催花生产的核心工艺之一。花芽内休眠调控机理是实现人工调控牡丹开花的理论基础。研究者利用组学技术和分子生物学技术发现了大量休眠调控相关的基因，然而如何从遗传角度上研究这些基因的功能，证明其调控了牡丹花芽内休眠，成了研究者不得不面对的难题。牡丹组培再生困难，而且童期长达3-5年，致使传统基因功能研究手段难以实现。为此，避开再生难和童期长的限制，建立有效的遗传转化技术鉴定休眠解除相关基因的功能，刻不容缓。经过鉴定的促进休眠解除的基因可为花期分子育种提供候选基因，建立相应的育种理论，并加深植物内休眠调控机理的认识。

2、牡丹花芽属混合芽，9月下旬至10月中旬形态分化基本完成，进入休眠状态，外被发达的鳞片。自然条件下，经过冬季低温诱导休眠解除，第二年春季花芽萌动，形成枝条和花。牡丹花芽被广泛用于离体快繁的研究，进行名贵珍稀品种的扩繁。除此之外，根蘖芽、鳞芽、腋芽、顶芽也被用作离体快繁的材料，但未见用于基因转化的报道。研究人员针对牡丹遗传转化体系进行了大量的工作，种胚、子叶和叶片等都作为遗传转化的外植体进行了尝试，进展仍较缓慢。花芽作为牡丹休眠发生的器官，迫切需要以其为受体，建立研究休眠调控的高效转基因体系，鉴定休眠调控候选基因的功能，为鉴定休眠调控基因、解析调控机理提供充分的证据，为花期分子育种提供候选基因，同时也可为其他木本植物休眠调控的基因功能鉴定提供借鉴。

3、病毒诱导的基因沉默vigs(virus-induced gene silencing)是近年来发展起来的一种转录后基因沉默现象，通过内源mrna序列特异性降解，从而导致目的基因的沉默。vigs得到了广泛的应用，花朵、幼苗、叶片等常用作侵染的材料，侵染后通过瓶插或者定植的方式处理材料，进行基因功能研究。然而，牡丹进入秋季，会形成芽，落叶，并进入休眠状态，这种休眠是针对芽而言的，即芽内休眠；芽只有经过一定时间的低温或者解除休眠试剂处理，才能萌发开花，牡丹花芽作为一种休眠器官，外被厚厚的鳞片，无法直接侵染，如何保证侵染成功率，侵染后又如何保证其正常生长，都是需要解决的难题。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定牡丹花芽休眠解除相关基因功能的转基因方法，所述方法能够鉴定基因是否与牡丹花芽休眠相关，以便后续用于解除牡丹花芽休眠。

2、本发明是通过如下技术方案来实现的：

3、一种鉴定牡丹花芽休眠解除相关基因功能的转基因方法，所述方法通过构建目标基因vigs载体转化农杆菌eha105，牡丹花芽消毒处理后，利用农杆菌侵染牡丹花芽，在1/2ms+100mm乙酰丁香酮培养基上，8℃黑暗条件共培养3d，转移到1/2ms+200mg/ml特美汀培养基上光照培养，5天后检测目标基因表达量，沉默有效率≥60％，所述沉默有效率为沉默效率≥50％芽的百分率，表明实验成功，进一步鉴定该基因是否与休眠解除相关；侵染10天后分析花芽生长状态，花芽生长状态根据处理组的生长增量与对照生长增量的比值进行衡量，比值超过1.5或小于0.67，且统计学上差异显著(p<0.05)，则该基因与休眠解除相关；定量pcr检测休眠解除基因(简称drgs，如psap2、pscycd、psebb1、psebb3、psbg6等)表达量，如果沉默目标基因后drgs基因的表达量显著高于或低于对照组，则该基因与休眠解除相关。

4、进一步，所述构建基因vigs载体：设计引物，扩增目标基因的编码序列或前体序列，将其插入trv2载体中去。

5、进一步，将牡丹花芽外层1-2层的芽鳞剥去，自来水冲洗40-60min；在的洗洁精溶液中浸泡10min；流水冲洗掉洗洁精，进一步消毒；并去清除残余灭菌剂。

6、进一步，所述的利用农杆菌侵染牡丹花芽：将处理好的牡丹花芽放入侵染液中，用真空泵对牡丹花芽进行抽吸侵染，当压强低至0.7个大气压，保持5min后缓慢放气。

7、本发明还提供基因psmir172b解除牡丹花芽内休眠中的应用。

8、本发明与现有技术相比的有益效果：

9、牡丹上尚无有效的鉴定休眠调控基因的方法。休眠状态下地上部仅有高度木质化的枝条和休眠的芽，而芽外被1-2层鳞片，侵染困难且不易培养。本发明创造性的将组织培养和vigs结合起来，并根据沉默目标基因后花芽相对生长量变化鉴定休眠解除相关基因，避开了牡丹组培再生困难、童期长、休眠状态下无法直接侵染等问题，实现了休眠解除相关基因的快速鉴定。

技术特征：

1.一种鉴定牡丹花芽休眠解除相关基因功能的转基因方法，其特征在于，所述方法通过构建目标基因vigs载体转化农杆菌eha105，牡丹花芽消毒处理后，利用农杆菌侵染牡丹花芽，在1/2ms+100mm乙酰丁香酮培养基上，8℃黑暗条件共培养3d，转移到1/2ms+200mg/ml特美汀培养基上光照培养，5天后检测目标基因表达量，沉默有效率≥60％，所述沉默有效率为沉默效率≥50％芽的百分率，表明实验成功，进一步鉴定该基因是否与休眠解除相关；侵染10天后分析花芽生长状态，花芽生长状态根据处理组的生长增量与对照生长增量的比值进行衡量，比值超过1.5或小于0.67，且统计学上差异显著，则该基因与休眠解除相关；定量pcr检测休眠解除基因drgs的表达量，如果沉默目标基因后drgs基因的表达量显著高于对照组，则该基因与休眠解除相关。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定牡丹花芽休眠解除相关基因功能的转基因方法，其特征在于，所述构建目标基因vigs载体：设计引物，扩增目标基因的编码序列或前体序列，将其插入trv2载体中去。

3.根据权利要求1所述的一种鉴定牡丹花芽休眠解除相关基因功能的转基因方法，其特征在于，将牡丹花芽外层1-2层的芽鳞剥去，自来水冲洗40-60min；在的洗洁精溶液中浸泡10min；流水冲洗掉洗洁精，进一步消毒；并去清除残余灭菌剂。

4.根据权利要求1所述的一种鉴定牡丹花芽休眠解除相关基因功能的转基因方法，其特征在于，所述的利用农杆菌侵染牡丹花芽：将处理好的牡丹花芽放入侵染液中，用真空泵对牡丹花芽进行抽吸侵染，当压强低至0.7个大气压，保持5min后缓慢放气。

5.一种应用，其特征在于，所述应用为利用权利要求1所述方法鉴定的基因沉默psmir172b基因解除牡丹花芽内休眠。

技术总结
本发明公开了一种鉴定牡丹花芽内休眠解除相关基因功能的方法及基因PsmiR172b应用，属于植物基因工程技术领域，所述方法通过构建目标基因VIGS载体转化农杆菌EHA105，牡丹花芽消毒处理后，利用农杆菌侵染牡丹花芽，在1/2MS+100mM乙酰丁香酮培养基上，8℃黑暗条件共培养3d，转移到1/2MS+200mg/mL特美汀培养基上光照培养，5天后检测目标基因表达量和花芽生长状态。本发明创造性的将组织培养和VIGS结合起来，并根据沉默目标基因后花芽相对生长量变化鉴定休眠解除相关基因，避开了牡丹组培再生困难、童期长、休眠状态下无法直接侵染等问题，实现了休眠解除相关基因的快速鉴定。

技术研发人员：盖树鹏,张玉喜,张涛,王新宇,袁延超,刘春英,李峰
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12