植物VIGS快速转基因瞬时转化

  植物快速转基因

■ 技术简介

　　植物病毒侵染植物后，会在整株植物中形成系统性扩散。利用这种特性，在植物病毒中插入外源基因，就能将其通过病毒的复制传递到整株植物中去并表达，从而在当代植物中就产生类似转化外源基因的效果，避免了稳定转化所需要的植株再生过程。

　　植物病毒载体主要有两种应用方式，一种是病毒介导的基因沉默技术（VIGS）。在病毒载体上装入植物内源靶基因片段，并接种植物后，病毒在植物体内产生系统性侵染，蔓延到全株，同时随着病毒基因组复制产生包含该基因片段的双链RNA（dsRNA）。这种dsRNA会触发植物防御的RNAi机制，定向降解植物内源的靶基因转录产生的mRNA，导致该目的基因功能的下调或抑制。结合植物表型变化进行分析，便可以了解该靶基因的功能。此外，在植物病毒载体上装入植物寄主（如昆虫、真菌、细菌等）靶基因的干扰序列，接种植物后可以研究对寄主的抗性。

　　另一种应用是将病毒做为目的基因表达载体，装入目的基因全长序列，侵染植物。由于病毒的扩散和复制很快，因此可以在整株植物内快速积累目的基因表达产物。如果目的基因是植物内源基因，此方法相对于稳定转化的过表达还具有独特的优势。因为稳定转化插入的目的基因会引发其内源基因的沉默，反而得不到过表达的植株，但在病毒载体上携带的目的基因却可以随同病毒基因组的复制和转录而大量表达。

　　以植物病毒做为基因载体，可以同时从正向遗传机制（过表达）和反向遗传机制（基因沉默）两方面研究目的基因功能。

　　我们已经在棉花、烟草、拟南芥、番茄、马铃薯、小麦、大麦（青稞）、甜菜、桑树等植物品种上成功建立了这种快速转基因技术体系，并在萝卜、辣椒、茄子、白菜、文冠果等植物上取得了初步成功。

棉花、烟草、番茄（从左至右）分别VIGS沉默PDS/SU基因后叶片系统性白化/黄化

　　优点：

 1.VIGS技术在当代植株上直接产生RNAi效果，大幅节约时间和成本；

 2.避免传统转基因体系的弊端，尤其适合转化体系不成熟的植物或受基因型限制的品种；

 3.VIGS技术可以同时实现多个基因的沉默；

 4.VIGS技术可以对缺失致死的基因进行表达下调研究；

 5.VIGS技术可以同时沉默基因家族中的单个或多个基因，解决基因家族冗余性问题。

　　局限：

 1.病毒载体适用的植物品种有所限制；

 2.病毒载体一般不能完全抑制目标基因表达，可能影响表型变化的判断；

 3.病毒载体在不同植株内和不同条件下引发的基因沉默效果可能存在差异。

■ 技术路线

VIGS棉花介导的棉铃虫RNAi靶基因筛选示意图

1.接种 2.叶片白化 3.虫试 4.抗虫效果

■ 实验选项

　　　　备注：

      1.合作方提供靶基因、PCR克隆模板材料等；

      2.可选择病毒或非病毒载体侵染植株；

      3.以实时定量PCR检测靶基因转录水平的变化，每批包括一组（3-5个）实验株及两组对照株；

      4.默认使用我方常用转化植物品种，如需指定其它品种，另行协商；

      5.因保守技术秘密，相关载体无法提供给合作方，敬请谅解。

■ 合作说明

1.全年均可开展项目实验；

2.每1个月向合作方提供项目报告，包括：

（1）进度描述

（2）载体构建测序报告和图片

（3）VIGS接种植株的表型观察照片

（4）VIGS接种植株的目标基因转录水平qRT-PCR检测(如有）结果

3.签订合同并收取50%预付款后3日内项目启动，交付标的物后5日内支付50%尾款，因客观因素或技术风险导致项目无法完成的，仅收取合同金额的30-50%作为成本补偿；

4.本合作限于为科研单位或种业公司提供技术支持，所交付的标的物仅为实验室规模的研究成果，不具备直接的商业用途，合作方应在国家相关法律法规的范围内使用，违者产生的后果自行负责，本公司不承担任何连带责任。

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