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用于茄子种质资源鉴定的分子标记组合及其应用的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-06-17 16:37

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于茄子种质资源鉴定的分子标记组合及其应用。

背景技术：

茄子(solanummelongenal.)是茄科茄属的重要栽培作物，含有皂草甙、维生素p、钙、磷等营养成分，具有较高的经济价值和营养价值，在世界各地广泛种植，是亚洲、中东、近东、南欧和非洲的重要蔬菜作物。茄子起源于亚洲热带地区，古印度为其最早驯化地，中国作为茄子的生产和消费大国，被认为是茄子第二起源地。

经多年驯化后茄子栽培种遗传背景相对狭窄，很多种质资源间具有相似的表型性状和遗传背景，给种质资源的鉴定增加了难度。目前茄子种质资源的鉴定方法主要是形态学方法，鉴别困难且不准确。分子标记具有不受环境因素影响、精确度高等优点，分子标记的开发和应用对茄子种质资源的鉴定具有重要意义。其中snp(singlenucleotidepolymorphism)和indel(insertion-deletion)标记具有分布广、密度高、稳定性好、变异丰富等特点，能直接反应植物基因水平的差异，是茄子种质资源鉴定的理想标记。

由于茄子(s.melongenal.)种内种质资源遗传差异较小，仅凭单个基因片段的多态位点难于成功鉴别不同资源和品种，本发明综合利用不同基因片段的snp和indel标记组合成功鉴定了12份茄子种质资源。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于茄子种质资源鉴定的分子标记组合及其应用。

为了实现本发明目的，发明人设计了可用于茄子pcr扩增的引物，并提供可用于茄子种质资源鉴定的snp和indel标记组合，成功筛选出具有特异单倍型的12份茄子种质资源。

第一方面，本发明提供用于茄子种质资源鉴定的分子标记组合，所述分子标记组合由si-1、si-5、si-9、si-14、si-15共5个indel标记以及si-2、si-3、si-4、si-6、si-7、si-8、si-10、si-11、si-12、si-13、si-16、si-17共12个snp标记组成。

标记si-1含有位于茄子基因组中如seqidno:19所示核苷酸序列第100bp处多态性为g/-的核苷酸序列；

标记si-2含有位于茄子基因组中如seqidno:19所示核苷酸序列第437bp处多态性为a/c的核苷酸序列；

标记si-3含有位于茄子基因组中如seqidno:20所示核苷酸序列第100bp处多态性为t/a的核苷酸序列；

标记si-4含有位于茄子基因组中如seqidno:20所示核苷酸序列第141bp处多态性为g/a的核苷酸序列；

标记si-5含有位于茄子基因组中如seqidno:20所示核苷酸序列第365～368bp处多态性为ctct/-的核苷酸序列；

标记si-6含有位于茄子基因组中如seqidno:21所示核苷酸序列第100bp处多态性为c/a的核苷酸序列；

标记si-7含有位于茄子基因组中如seqidno:22所示核苷酸序列第54bp处多态性为g/a的核苷酸序列；

标记si-8含有位于茄子基因组中如seqidno:22所示核苷酸序列第78bp处多态性为c/g的核苷酸序列；

标记si-9含有位于茄子基因组中如seqidno:23所示核苷酸序列第28～33bp处多态性为gctaga/-的核苷酸序列；

标记si-10含有位于茄子基因组中如seqidno:23所示核苷酸序列第569bp处多态性为c/t的核苷酸序列；

标记si-11含有位于茄子基因组中如seqidno:24所示核苷酸序列第100bp处多态性为t/a的核苷酸序列；

标记si-12含有位于茄子基因组中如seqidno:24所示核苷酸序列第118bp处多态性为c/t的核苷酸序列；

标记si-13含有位于茄子基因组中如seqidno:24所示核苷酸序列第329bp处多态性为g/c的核苷酸序列；

标记si-14含有位于茄子基因组中如seqidno:25所示核苷酸序列第116bp处多态性为g/-的核苷酸序列；

标记si-15含有位于茄子基因组中如seqidno:25所示核苷酸序列第354～364bp处多态性为aatgtataaca/-的核苷酸序列；

标记si-16含有位于茄子基因组中如seqidno:26所示核苷酸序列第100bp处多态性为t/a的核苷酸序列；

标记si-17含有位于茄子基因组中如seqidno:27所示核苷酸序列第100bp处多态性为t/g的核苷酸序列；

其中，所述茄子种质资源选自湘早茄、胭脂茄(v06b0149)、狗尾巴茄(v06b0458)、黑美丽(v06b0541)、vetrioe(v06b0543)、红皮寒茄(v06b0552)、南丰线茄(v06b0556)、歙县圆白茄(v06b0978)、藤桥紫茄(v06b1046)、油罐茄(v06b0357)、紫圆茄(v06b0940)、五爪茄(v06b1256)。

第二方面，本发明提供用于所述分子标记组合的引物，包括如下①～⑨共9组引物：

①用于扩增标记si-1、si-2的引物序列如seqidno:1和seqidno:2所示；

②用于扩增标记si-3、si-4、si-5的引物序列如seqidno:3和seqidno:4所示；

③用于扩增标记si-6的引物序列如seqidno:5和seqidno:6所示；

④用于扩增标记si-7、si-8的引物序列如seqidno:7和seqidno:8所示；

⑤用于扩增标记si-9、si-10的引物序列如seqidno:9和seqidno:10所示；

⑥用于扩增标记si-11、si-12、si-13的引物序列如seqidno:11和seqidno:12所示；其中，

⑦用于扩增标记si-14、si-15的引物序列如seqidno:13和seqidno:14所示；其中，

⑧用于扩增标记si-16的引物序列如seqidno:15和seqidno:16所示；

⑨用于扩增标记si-17的引物序列如seqidno:17和seqidno:18所示。

上述引物序列中，r表示简并碱基a或g，y表示简并碱基c或t，d表示简并碱基g、a或t，m表示简并碱基a或c，s表示简并碱基g或c，w表示简并碱基a或t，k表示简并碱基g或t。

第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供所述分子标记组合、所述引物，或者所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

1)用于茄子种质资源鉴定；

2)用于茄子dna指纹图谱构建；

3)用于茄子分子标记辅助育种。

第五方面，本发明提供一种鉴别茄子种质资源的方法，包括如下步骤：

(1)以待测茄子材料的基因组dna为模板，利用权利要求2所述引物进行pcr扩增，得到pcr产物；

(2)分析pcr产物。

步骤(2)具体为：对pcr产物进行测序，将测序结果与“分子标记组合xii”进行比对，所述“分子标记组合xii”为如下a1)～a12)共12个组合：

a1)gsi-1asi-2tsi-3asi-4(ctct)si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10tsi-11csi-12gsi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

a2)gsi-1asi-2asi-3asi-4(ctct)si-5asi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10tsi-11csi-12gsi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

a3)-si-1csi-2tsi-3gsi-4-si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10asi-11tsi-12csi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

a4)gsi-1asi-2asi-3asi-4(ctct)si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9tsi-10tsi-11csi-12gsi-13asi-14(aatgtataaca)si-15tsi-16tsi-17；

a5)-si-1csi-2asi-3asi-4-si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10tsi-11csi-12gsi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

a6)gsi-1asi-2asi-3asi-4(ctct)si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10asi-11tsi-12csi-13asi-14(aatgtataaca)si-15tsi-16tsi-17；

a7)gsi-1asi-2tsi-3gsi-4-si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10wsi-11ysi-12ssi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

a8)gsi-1asi-2asi-3asi-4(ctct)si-5csi-6gsi-7csi-8-si-9csi-10tsi-11csi-12gsi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

a9)gsi-1asi-2asi-3asi-4(ctct)si-5asi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10tsi-11csi-12gsi-13gsi-14-si-15tsi-16gsi-17；

a10)gsi-1asi-2tsi-3gsi-4-si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10tsi-11csi-12gsi-13gsi-14-si-15asi-16tsi-17；

a11)gsi-1asi-2tsi-3gsi-4-si-5csi-6gsi-7csi-8(gctaga)si-9csi-10asi-11tsi-12csi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

a12)gsi-1asi-2asi-3asi-4(ctct)si-5csi-6gsi-7gsi-8(gctaga)si-9csi-10tsi-11csi-12gsi-13gsi-14-si-15tsi-16tsi-17；

上述分子标记组合中，-表示碱基缺失；w表示a和t；y表示c和t；s表示g和c(即所述待测茄子种质资源的相应位点为杂合位点)；

其中，所述si-1为indel位点，位于茄子基因组中如seqidno:19所示核苷酸序列的第100位碱基n，该indel位点为g/-多态；

所述si-2为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:19所示核苷酸序列的第437位碱基n，该snp位点为a/c多态；

所述si-3为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:20所示核苷酸序列的第100位碱基n，该snp位点为t/a多态；

所述si-4为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:20所示核苷酸序列的第141位碱基n，该snp位点为g/a多态；

所述si-5为indel位点，位于茄子基因组中如seqidno:20所示核苷酸序列的第365～368位碱基nnnn，该indel位点为ctct/-多态；

所述si-6为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:21所示核苷酸序列的第100位碱基n，该snp位点为c/a多态；

所述si-7为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:22所示核苷酸序列的第54位碱基n，该snp位点为g/a多态；

所述si-8为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:22所示核苷酸序列的第78位碱基n，该snp位点为c/g多态；

所述si-9为indel位点，位于茄子基因组中如seqidno:23所示核苷酸序列的第28～33位碱基nnnnnn，该indel位点为gctaga/-多态；

所述si-10为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:23所示核苷酸序列的第569位碱基n，该snp位点为c/t多态；

所述si-11为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:24所示核苷酸序列的第100位碱基n，该snp位点为t/a多态；

所述si-12为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:24所示核苷酸序列的第118位碱基n，该snp位点为c/t多态；

所述si-13为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:24所示核苷酸序列的第329位碱基n，该snp位点为g/c多态；

所述si-14为indel位点，位于茄子基因组中如seqidno:25所示核苷酸序列的第116位碱基n，该indel位点为g/-多态；

所述si-15为indel位点，位于茄子基因组中如seqidno:25所示核苷酸序列的第354～364位碱基nnnnnnnnnnn，该indel位点为aatgtataaca/-多态；

所述si-16为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:26所示核苷酸序列的第100位碱基n，该snp位点为t/a多态；

所述si-17为snp位点，位于茄子基因组中如seqidno:27所示核苷酸序列的第100位碱基n，该snp位点为t/g多态；

最后，根据比对结果，对所述待测茄子材料进行鉴定：

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a1)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为湘早茄；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a2)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为胭脂茄(v06b0149)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a3)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为狗尾巴茄(v06b0458)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a4)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为黑美丽(v06b0541)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a5)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为vetrioe(v06b0543)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a6)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为红皮寒茄(v06b0552)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a7)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为南丰线茄(v06b0556)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a8)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为歙县圆白茄(v06b0978)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a9)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为藤桥紫茄(v06b1046)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a10)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为油罐茄(v06b0357)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a11)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为紫圆茄(v06b0940)；

若所述待测茄子材料的分子标记组合为a12)所示的分子标记组合，则所述待测茄子为或候选为五爪茄(v06b1256)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的方法鉴定茄子种质资源精确可靠，可提高茄子种质资源的管理和保护力度，有效弥补以往方法的不足。

(二)本发明提供的鉴定茄子种质资源的分子标记组合简化了鉴别程序，操作简单，重现性好，利于推广。

(三)本发明从基因水平上拓展了茄子可用标记位点范围，为茄子种质资源鉴定提供了新思路和方法。

(四)本发明的应用为杂交育种中亲本的选配奠定了基础，为育种和生产中种质资源选择的准确性提供了保障，对茄子种质资源鉴定，dna指纹图谱绘制，品种保护和管理等方面具有重要理论与应用价值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的茄子材料：湘早茄为商业品种，胭脂茄(v06b0149)、狗尾巴茄(v06b0458)、黑美丽(v06b0541)、vetrioe(v06b0543)、红皮寒茄(v06b0552)、南丰线茄(v06b0556)、歙县圆白茄(v06b0978)、藤桥紫茄(v06b1046)、油罐茄(v06b0357)、紫圆茄(v06b0940)和五爪茄(v06b1256)来源于国家种质库。

实施例1利用snp和indel标记组合鉴定茄子种质资源方法的建立及其应用

1、实验材料

实验材料包括55份茄子材料：湘早茄、胭脂茄(v06b0149)、狗尾巴茄(v06b0458)、黑美丽(v06b0541)、vetrioe(v06b0543)、红皮寒茄(v06b0552)、南丰线茄(v06b0556)、歙县圆白茄(v06b0978)、藤桥紫茄(v06b1046)、油罐茄(v06b0357)、紫圆茄(v06b0940)、五爪茄(v06b1256)、竹丝茄、六叶茄(v06b0039)、白茄(v06b0066)、紫长茄(v06b0092)、黄鳝头茄子(v06b1231)、永安银珠茄(v06b0108)、白象伢仔(v06b0117)、旺步紫长茄(v06b0150)、黑油茄(v06b0476)、瘪茄(v06b0841)、六叶茄(v06b1027)、黑五叶茄(v06b1103)、新安大青茄(v06b1108)、86-1花培茄子(v06b1131)、青茄(v06b1134)、白茄子(v06b1186)、新长畸(v06b1187)、苏州牛角(v06b1188)、糙青茄子(v06b1199)、萍乡白茄(v06b1204)、宁波藤茄(v06b1257)、弄口红茄(v06b1258)、fleralba(v06b1338)、白圆茄(v06b1387)、江口荷包茄(v06b0559)、诸城牛腿茄(v06b0677)、四叶茄(v06b0774)、襄县糙青茄(v06b1119)、有刺野生(v06b0140)、小绿茄(v06b1297)、青圆茄(v06b1363)、花茄子(v06b1043)、韶关野茄、改良托托斯加、改良托鲁巴姆、红茄(海南引种)、巴西绿茄(v06b1200)、yzcm(v06b1305)、刚果茄(v06b0523)、观赏茄(v06b0846)、珍珠茄(v06b1220)、观赏茄(v06b1233)、soclanumgibo(v06b1349)和melanzanaebany(v06b1299)。

2、引物设计

为了构建能用于有效鉴定茄子种质资源的snp和indel标记组合，本发明随机挑选位于茄子不同染色体的单拷贝基因，为其设计保守引物，通过对pcr引物进行筛选验证，最终确定9组引物用于茄子种质资源的鉴定。引物一为seqidno:1和seqidno:2，引物二为seqidno:3和seqidno:4，引物三为seqidno:5和seqidno:6，引物四为seqidno:7和seqidno:8，引物五为seqidno:9和seqidno:10，引物六为seqidno:11和seqidno:12，引物七为seqidno:13和seqidno:14，引物八为seqidno:15和seqidno:16，引物九为seqidno:17和seqidno:18。

3、pcr产物序列测定及多态位点筛选

以供试材料的幼嫩叶片为实验材料，采用ctab法提取植物dna，以植物dna为模板，用步骤二中的引物对其进行pcr扩增。结果显示，每份茄子种质资源均可得到一条清晰的特异条带。将pcr产物送测序，将两端质量差的序列删除，保留中间质量高的序列。利用muscle脚本将供试茄子的9个基因片段分别进行比对，筛选其中的snp和indel多态性位点。

结果显示，筛选得到的snp和indel多态性位点如下：

si-1和si-2分别为indel和snp位点，位于seqidno:19所示核苷酸序列的第100位和第437位；si-3、si-4、si-5分别为snp位点、snp位点和indel位点，分别位于seqidno:20所示核苷酸序列的第100位、第141位和第365～368位；si-6为snp位点，位于seqidno:21所示核苷酸序列的第100位；si-7和si-8为snp位点，位于seqidno:22所示核苷酸序列的第54位和第78位；si-9和si-10分别为indel位点和snp位点，位于seqidno:23所示核苷酸序列的第28～33位和第569位；si-11、si-12和si-13为snp位点，分别位于seqidno:24所示核苷酸序列的第100位、第118位和第329位；所述的si-14和si-15为indel位点，分别位于seqidno:25所示核苷酸序列的第116位和第354～364位；si-16为snp位点，位于seqidno:26所示核苷酸序列的第100位；si-17为snp位点，位于seqidno:27所示核苷酸序列的第100位。

4、茄子种质资源分子标记组合的构建

将步骤二中筛选得到的17个多态位点从55份材料中截取出来并按顺序排列，从中筛选出12个特异单倍型，组成12个分子标记组合：