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一种红掌多倍体的高效诱导方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-05-15 04:39

一种红掌多倍体的高效诱导方法与流程

本发明属于植物育种领域，涉及一种植物多倍体的诱导方法，具体涉及一种红掌多倍体的高效诱导方法。

背景技术：

红掌(Anthurium andraeanum Lind)又名安祖花、花烛等，为天南星科(Araceae)安祖花属(Anthurium)多年生草本植物，原产于哥伦比亚、厄瓜多尔、哥斯达黎加等地，喜温暖、湿热的环境。花型奇特，花色多样的优点，深受世界各国人民的喜。近年来我国红掌产业发展迅猛，目前已成为世界主产地和消费地之一。

红掌新品种创制主要手段是有性杂交和后代选择。然而传统杂交育种周期比较长，一个品种的选育通常耗时6～8年，且花烛属是引进种质，在国内无原生种分布，世界各国也加强了对野生资源的保护，这在很大程度上限制了红掌育种亲本来源。目前国内种质资源多为国外公司推广的商业品种，遗传基础相对狭窄，这些品种间的杂交后代往往会出现同质性，很难获得更特异的新品系。此外，目前红掌育种目标主要关注花色、株型等观赏性状，在抗病虫害、抗逆境胁迫等方向涉及甚少。上述问题，传统的杂交手段不能有效解决，开展其他育种技术研究有非常紧迫的现实意义。

多倍体植物常表现出花斑多、花色艳丽、花期长、叶片肥厚、抗性增强等特点。观赏价值和经济价值均得到普遍提高。利用染色体加倍，可以人工创造新的植物类型，用多倍体做亲本，有利于克服远缘杂交不亲和性。

因此多倍体育种是观赏植物常用的育种途径之一，如何高效获得多倍体种质就尤为关键。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种操作简单，稳定性高，诱导率高，鉴定效率高，育种周期短的红掌多倍体的高效诱导方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种红掌多倍体的高效诱导方法，其中，包括以下步骤：

(1)愈伤组织预培养：取红掌愈伤组织接种于预培养基中15d，待愈伤组织生长出凸起状生长点时备用；所述预培养基成分为1/2MS+1g/L花宝1号+2～3mg/L 6-BA+0.5～1mg/L NAA+0.5～2mg/L 2,4-D+0.5～1.0mg/L TDZ+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖，pH值为5.8～6.2；

(2)多倍体诱导：将步骤(1)预培养获得的愈伤组织切成0.5cm×0.5cm大小的团块浸泡于100～400mg/L的秋水仙碱溶液中振荡培养5～15d；

(3)愈伤组织分化培养：将步骤(2)中处理过的愈伤组织经无菌水清洗后接种至分化培养基中，分化培养基成分为1/2MS+1g/L花宝1号+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖，pH值为5.8～6.2；

(4)生根培养：将步骤(3)中获得的分化苗接种至生根培养基中，生根培养基成分为1/2MS+0.2mg/L NAA+0.5g/L AC(活性炭)+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖，pH值为5.8～6.2；每30d天继代一次，继代3次后出瓶驯化栽培；

(5)驯化栽培：将步骤(4)中获得的生根苗移栽至装有1:1:1的椰糠，蛭石，泥炭土混合基质的穴盘种，置于温室中培养60d，温室环境控制在温度24～26℃，湿度保持在80％～95％。

(6)多倍体鉴定：取步骤(5)中生根苗培养60d后生长出的幼嫩叶片经WPB缓冲液裂解后进行流式细胞仪倍性检测，经流式细胞仪检测后的疑似多倍体植株进一步进行染色体制片观察确定，计算多倍体诱导率。多倍体诱导率＝多倍体数/分化苗数×100％。

附图说明

图1为本发明愈伤组织处理示意图；

图2为本发明愈伤组织分化示意图；

图3为本发明植株形态比较图(左：二倍体；右：四倍体)；

图4为本发明流式倍性鉴定图(二倍体)；

图5为本发明流式倍性鉴定图(四倍体)；

图6为本发明染色体鉴定图(二倍体2n＝30)；

图7为本发明染色体鉴定图(四倍体2n＝60)。

具体实施方式

实施例1

(1)取红掌品种‘大哥大’愈伤组织接种于培养基1/2MS+1g/L花宝1号+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中预培养培15d(图1)；

(2)待愈伤组织生长出凸起状生长点时将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm大小的团块浸泡于100mg/L的秋水仙碱溶液中振荡培养5d；

(3)经无菌水清洗后接种于分化培养基1/2MS+1g/L花宝1号+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中分化培养(图2)；45d统计愈伤组织存活率，存活率＝存活数/接种数×100％；

(4)将分化苗接种至生根培养基1/2MS+0.2mg/L NAA+0.5g/L AC+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中生根培养，每30d天继代一次；

(5)继代3次后将生根苗移栽至装有1:1:1的椰糠，蛭石，泥炭土混合基质的穴盘种，置于温室中培养60d(图3)。温室环境控制在温度24℃，湿度保持在85％。

(6)生根苗培养60d后生长出的幼嫩叶片经WPB缓冲液裂解后进行流式细胞仪倍性检测(图4、图5)，四倍体峰值在400通道(对照峰值在200通道)。经流式细胞仪检测后的疑似多倍体植株进一步进行染色体制片观察确定(图6、图7)，四倍体染色体2n＝60(对照染色体条数2n＝30)。计算多倍体诱导率如表1所示。

实施例2

(1)取红掌品种‘大哥大’愈伤组织接种于培养基1/2MS+1g/L花宝1号+3mg/L 6-BA+1mg/L NAA+2mg/L 2,4-D+1.0mg/L TDZ+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中预培养培15d；

(2)待愈伤组织生长出凸起状生长点时将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm大小的团块浸泡于200mg/L的秋水仙碱溶液中振荡培养10d；

(3)经无菌水清洗后接种于分化培养基1/2MS+1g/L花宝1号+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中分化培养；45d统计愈伤组织存活率，存活率＝存活数/接种数×100％；

(4)分化苗接种至生根培养基1/2MS+0.2mg/L NAA+0.5g/L AC+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中生根培养，每30d天继代一次；

(5)继代3次后将生根苗移栽至装有1:1:1的椰糠，蛭石，泥炭土混合基质的穴盘种，置于温室中培养60d，温室环境控制在温度26℃，湿度保持在90％。

(6)生根苗培养60d后生长出的幼嫩叶片经WPB缓冲液裂解后进行流式细胞仪倍性检测，四倍体峰值在400通道(对照峰值在200通道)。经流式细胞仪检测后的疑似多倍体植株进一步进行染色体制片观察确定，四倍体染色体2n＝60(对照染色体条数2n＝30)。计算多倍体诱导率如表1所示。

实施例3

(1)取红掌品种‘大哥大’愈伤组织接种于培养基1/2MS+1g/L花宝1号+2.5mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+1mg/L 2,4-D+0.8mg/L TDZ+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中预培养培15d；

(2)待愈伤组织生长出凸起状生长点时将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm大小的团块浸泡于400mg/L的秋水仙碱溶液中振荡培养15d；

(4)分化苗接种至生根培养基1/2MS+0.2mg/L NAA+0.5g/L AC+7g/L琼脂粉+30g/L蔗糖中生根培养，每30d天继代一次；

(5)继代3次后将生根苗移栽至装有1:1:1的椰糠，蛭石，泥炭土混合基质的穴盘种，置于温室中培养60d；温室环境控制在温度25℃，湿度保持在95％；

表1 秋水仙碱浓度及处理时间对红掌多倍体诱导影响

注:显著水平p＝0.01。

从表1可以看出，愈伤组织存活率随着处理浓度和时间的增加呈现逐渐降低的趋势，处理1(对照)最高，处理10(400mg/L，15d)最低，各处理极显著低于对照(处理1)。多倍体诱导率随着处理浓度和时间的增加呈现先升高后降低的趋势，处理1(对照)最低，处理7(200mg/L，15d)最高，各处理极显著高于对照(处理1)，处理6(200mg/L，10d)和处理7(200mg/L，15d)差异不显著，但极显著于其他处理。综合以上因素，处理6(200mg/L，10d)效果最好，存活率和诱导率高。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。