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一种高效创建国兰有性多倍体的方法.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-04-25 10:01

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710561524.1 (22)申请日 2017.07.11 (71)申请人华南农业大学地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人曾瑞珍雷蕾郭和蓉杜国辉谢利朱娇张志胜 (74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司 44102 代理人任重 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称一种高效创建国兰有性多倍体的方法 (57)摘要本发明属于植物多倍。

2、体育种技术领域，具体公开一种高效创建国兰有性多倍体的方法。所述方法通过选择高效发生2n配子资源进行杂交，对杂种种子进行培养形成中间繁殖体，对中间繁殖体进行观察，选择拟似多倍性中间繁殖体进行分化生产后代苗，采用形态学、流式细胞仪和根尖染色体压片对后代苗进行鉴定，获得兰花有性多倍体。本发明提供的方法将植物倍性优势和杂交优势有效结合，同时建立高效创建国兰有性多倍体技术体系，对提高我国国兰产业的核心竞争力和效益、尽快缩小我国兰花育种和国外的差距、促进花卉产业高效可持续发展具有十分重要意义。权利要求书2页说明书4页附图3页 CN 107347627 。

3、A 2017.11.17 CN 107347627 A 1.一种高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤： S1. 亲本选择和杂交组合配置：选择高效发生2n配子的杂交兰或国兰做亲本，配置杂交组合，获得果实； S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定：对兰花种子进行无菌培养获得中间繁殖体，将单粒种子形成的中间繁殖体进行继代增殖培养，观察中间繁殖体形态、生长速度，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体； S3. 植株再生和试管苗形态观察：对选到的中间繁殖体进行分化培养和生根壮苗培养，对形成的再生植株进行形态学观察，选择国兰株型、植株粗壮、叶色深。

4、、叶厚、根粗壮、根尖端圆钝的植株； S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得：对当选的植株进行测定，染色体数为60条或以上的为多倍体。 2.根据权利要求1所述高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，步骤S1亲本选择中母本为小香，父本为兔耳兰。 3.根据权利要求1所述高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下步骤： S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后150-270天的果实洗净，然后用75%乙醇消毒810分钟，无菌水冲洗35次，取其内部种子接种到固体培养基上培养；培养条件为温度 26，暗培养； S22. 中间繁殖体的增殖：将。

5、种子萌发后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成长度28 mm小段，分别接种于继代培养基上培养；培养条件为温度26，每日光照 812小时，光照强度5001000lux； S23. 中间繁殖体形态观察：对中间繁殖体的繁殖速度、形态特征进行观察，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体。 4.根据权利要求3所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于， S21所述固体培养基配方为： 1/2MS培养基+0.20.5mg/L 6-BA+0.10.2mg/L NAA+1020% （v/v）椰子汁+30g/L糖+0.32g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。 5.。

6、根据权利要求3所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，所述的步骤 S22中增殖培养基配方为1/2MS培养基+0.52 mg/L 6-BA+0.10.2mg/L NAA+0.20.5g/ L 活性碳+30g/L糖+7.5g/L卡拉胶。 6.根据权利要求1所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于， S3所述植株再生和试管苗形态观察包括如下步骤： S31. 芽分化培养：将继代培养的中间繁殖体分开，接种于芽分化培养基上培养，培养条件为温度26，每日光照10小时，光照强度10002000lux； S32. 生根壮苗培养：将高24cm从中间繁殖体上切下，接种到生根壮苗。

7、培养基上培养，培养条件为温度26，每日光照10小时，光照强度10002000lux； S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，生长慢、形成过程时间长，粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝的试管苗为拟似多倍体，以形态正常的植株做对照。 7.根据权利要求6所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于， S31所述的芽分化培养基配方为： 1/2MS培养基+1.52.0mg/L 6-BA+0.11mg/L NAA+30g/L糖+0 权利要求书 1/2 页 2 CN 107347627 A 2 0.3g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。 8.根据权利。

8、要求6所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，步骤S32中生根壮苗培养基配方为： 1/2MS培养基+0.10.2mg/L 6-BA+0.52mg/L NAA+2040g/L糖+ 0.20.5g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。 9.根据权利要求1所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于， S4包括以下步骤： S41. 流式细胞仪鉴定：以试管苗叶片为材料，根尖细胞染色体为40的二倍体为对照，采用Partec-cyview85流式细胞仪确定当选拟似多倍体植株的倍性； S42. 根尖细胞染色体鉴定：以幼嫩根尖为材料，采用压片法鉴定当选试管苗根尖细胞染色体数，染色体。

9、数为40时为二倍体，染色体为60或以上时为多倍体； S43. 有性多倍体的获得：将确定为多倍体的试管苗进行移栽和栽培，即可获得有性多倍体。权利要求书 2/2 页 3 CN 107347627 A 3 一种高效创建国兰有性多倍体的方法技术领域 0001 本发明属于植物多倍体育种技术领域，具体地涉及一种高效创建国兰有性多倍体的方法。背景技术 0002 国兰（Chinese Cymbidium）是指兰属植物中一部分产于东亚温带至热带地区的地生种类：包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰、春剑、套叶兰、莎叶兰、邱北冬蕙兰、峨嵋春蕙、兔耳兰、。

10、宽叶兰、落叶兰等。国兰香气宜人、株型秀美、花色雅致，是中国传统文化的物质载体，素有 “花中君子” 之称，在我国已有1000多年的栽培历史。随着国兰产业化发展和人们物质文化生活水平的不断提高，国兰开始走进寻常百姓家，受到越来越多消费者的喜爱，其市场前景十分广阔。 0003 多倍体具有植株粗壮、叶片宽厚、花大而艳丽、内含物多、对次生代谢物的积累强以及抗逆性强等优点，还能够克服远缘杂交不亲和，增加物种的多样性，大大的提高了花卉的观赏性和经济价值。多倍体育种是兰花育种的重要方法。目前商业化的大花蕙兰、蝴蝶兰、石斛兰品种大多数都是多倍体品种。但目前。

11、产业化生产的国兰品种都是二倍体品种。为了培育国兰多倍体品种，已有研究者通过秋水仙素处理的方法获得墨兰、春兰、寒兰、春剑等无性多倍体的报道。但用秋水仙素诱导产生的多倍体存活率低，生长慢、难繁殖，较难在生产上直接利用。 0004 利用2n配子途径创造多倍体可将植物倍性优势和杂交优势有效结合，快速育成能适应产业化要求、突破性的植物新品种。因此，研究通过2n配子途径创造国兰多倍体，建立高效创建国兰有性多倍体技术体系，对提高我国国兰产业的核心竞争力和效益、尽快缩小我国兰花育种和国外的差距、促进花卉产业高效可持续发展具有十分重要意义。发明内容 0005 本发。

12、明的目的是提供一种高效创建国兰有性多倍体的方法。 0006 一种高效创建国兰有性多倍体的方法，包括以下步骤： S1. 亲本选择和杂交组合配置：选择高效发生2n配子的杂交兰或国兰做亲本，配置杂交组合，获得果实； S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定：对兰花种子进行无菌培养获得中间繁殖体（一般为根状茎），将单粒种子形成的中间繁殖体进行继代增殖培养，观察中间繁殖体形态、生长速度，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体； S3. 植株再生和试管苗形态观察：对选到的中间繁殖体进行分化培养和生根壮苗培养，对形成的再生植株进行形态学观察，选择国兰株型、植株粗壮、。

13、叶色深、叶厚、根粗壮、根尖端圆钝的植株； S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得：对当选的植株进行流式细胞仪测定和根尖染色体数测定，染色体数为60条或以上的为多倍体。说明书 1/4 页 4 CN 107347627 A 4 0007 优选地， S1亲本选择中母本为小香，父本为兔耳兰。 0008 进一步地， S2包括以下步骤： S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后150270天左右的果实洗净，然后用75%乙醇消毒810分钟，无菌水冲洗35次，取其内部种子接种到固体培养基上培养；培养条件为温度26左右，暗培养； S22. 中间繁殖体的增殖：将种子萌发。

14、后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成长度28mm小段，分别接种于继代培养基上培养；培养条件为温度26左右，每日光照812小时，光照强度5001000lux； S23. 中间繁殖体形态观察：对中间繁殖体的繁殖速度、形态特征进行观察，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体。 0009 更进一步地，所述的步骤S21中固体培养基配方1/2MS培养基+0.20.5mg/L 6-BA +0.10.2mg/L NAA+1020% （v/v）椰子汁+30g/L糖+0.32g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶；所述的步骤S22中固体培养基配方为1/2MS培养基+0.。

15、52 mg/l 6-BA+0.10.2mg/l NAA+0.20.5g/L 活性碳+30g/L糖+7.5g/L卡拉胶。 0010 步骤S3中所述植株再生和试管苗形态观察包括如下步骤： S31. 芽分化培养：将继代培养的中间繁殖体分开，接种于芽分化培养基上培养，培养条件为温度26左右，每日光照10小时，光照强度10002000lux； S32. 生根壮苗培养：将高24cm从中间繁殖体上切下，接种到生根壮苗培养基上培养，培养条件为温度26左右，每日光照10小时，光照强度10002000lux； S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，生长慢、形成过程时间长，。

16、粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝的试管苗为拟似多倍体，以形态正常的植株做对照；更进一步地，步骤S31中所述的芽分化培养基配方为1/2MS培养基+1.52.0mg/L 6-BA +0.11mg/L NAA+30g/L糖+00.3g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。 0011 步骤S33中所述的生根壮苗培养基配方为1/2MS培养基+0.10.2mg/l 6-BA+0.5 2mg/l NAA+2040g/L糖+0.20.5g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。 0012 步骤S4所述的细胞学鉴定和有性多倍体的获得包括以下步骤： S41. 流式细胞仪鉴定：以试管苗叶片为材料，根。

17、尖细胞染色体为40的二倍体为对照，采用Partec-cyview85流式细胞仪确定当选拟似多倍体植株的倍性。 0013 S42. 根尖细胞染色体鉴定：以幼嫩根尖为材料，采用压片法鉴定当选试管苗根尖细胞染色体数，染色体数为40时为二倍体，染色体为60或以上时为多倍体。 0014 S43. 有性多倍体的获得：将确定为多倍体的试管苗进行移栽和栽培，即可获得有性多倍体。 0015 本发明利用上述方法，在步骤S1中按照母本为小香，父本为兔耳兰进行杂交。结果显示多倍体发生率分别达到1.85%和3.45%，表明通过本发明的2n配子途径和一系列的国兰有性多倍体技术体系处理，能够。

18、高效获得国兰有性多倍体。 0016 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）本发明利用高效发生2n配子资源，提高了利用2n配子途径创建国兰有性多倍体的效率，为利用多倍体育种方法培育多倍体国兰新品种提供了可行的途径；（2）获得有性多倍体集倍性优势和杂交优势于一身，和无性多倍体相比具有生长速度快，生长势强等特点，可说明书 2/4 页 5 CN 107347627 A 5 以直接作为新品种推广，这些新品种具有更强的市场竞争力，经济效益和社会效益都将十分明显。附图说明 0017 图1为本发明高效创建国兰有性多倍体的方法流程图。 0018 图2为表1中HX-2组。

19、合有性多倍体的鉴定，其中， a. 四倍体HX-2-21 （左）和二倍体 HX-2 （右）中间繁殖体； b. 四倍体HX-2-21 （左）和二倍体HX-2 （右）试管苗； c. 四倍体HX-2- 21流式细胞图； d. 四倍体HX-2-21根尖染色体（2n=4x=80） e.二倍体HX-2流式细胞图； f. 二倍体HX-2根尖染色体（2n=2x=40）。 0019 图3为表1中HX-3组合有性多倍体的鉴定，其中， a. 三倍体（左和中）和二倍体（右）中间繁殖体； b. 三倍体（左和中）和二倍体（右）试管苗； c. 三倍体流式细胞图； d. 三倍体根尖染色体。

20、（2n=3x=60） e. 二倍体流式细胞图； f. 二倍体根尖染色体（2n=2x=40）。具体实施方式 0020 下面结合具体的实例和附图对本发明做进一步的阐述，但具体实例并不对本发明做任何的限定。以下实例中所述培养基、试剂等均为本领域的普通技术人员通过购买可以得到。 0021 实施例1：墨兰有性多倍体资源的创建 2012年开始我们用本发明所述的方法进行墨兰有性多倍体资源创建，具体方法如下（流程如图1所示）： S1. 亲本选配和杂交组合配置：选择2n雄配子发生率高的06-bs-45-32 （2n雄配子发生率2.67）和06-bs-45-17 （2n雄配子发生率3。

21、.92）为亲本材料， 2012年2月20日分别以06-bs- 45-32和06-bs-45-17为母本、 06-bs-45-17为父本配制杂交组合，同年10月18日收获果实。 0022 其中， 2n雄配子发生率高的06-bs-45-32 （2n雄配子发生率2.67）和06-bs-45-17 （2n雄配子发生率3.92）的获得方法参见专利201310668763.9公开的内容。 0023 S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定： S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后发育240天的果实用用解剖刀去掉果柄，修理果实顶部，蘸取洗洁精刷洗后用自来水冲洗56 min，晾干，在超净工。

22、作台上用75 %的酒精浸泡810 min，无菌水冲洗35次后，用无菌解剖刀切开取其内部种子接种到1/2MS+6- BA （6-苄基腺膘呤） 0.5 mgL-1+NAA （萘乙酸） 0.2 mgL-1+蔗糖30 gL-1 +卡拉胶7.5g L-1 +CW （椰子汁） 100 mlL-1+AC （活性炭） 0.5 gL-1的固体培养基上培养。培养条件为温度26左右，暗培养。 0024 S22. 中间繁殖体的增殖和鉴定：将种子萌发后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成直径23 mm小块，分别接种于1/2MS+6-BA1.0 mgL-1 + NAA0.2 mgL-1+蔗。

23、糖30 gL-1+卡拉胶7.5 gL-1 + AC0.5 gL-1 的固体培养基上培养。培养条件为温度26左右，每日光照12小时，光照强度1000lux。观察各种子形成的中间繁殖体形态、生长速度，发现在06-bs-45-3206-bs-45-17组合中有2个种子萌发形成的根状茎粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢，在06-bs-45-1706-bs-45-17的组合中有1个种子萌发形成的根状茎粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢（图2-a和图3-a）。说明书 3/4 页 6 CN 107347627 A 6 0025 S3. 植株再生和试管苗形态观察： S31.分化培养。

24、：将中间繁殖体分开，分别接种到1/2MS+ 6-BA 1.52.0 mgL-1 + NAA 0.20.5 mgL-1 +30 gL-1蔗糖+卡拉胶7.5 gL-1的固体培养基上进行芽分化培养。培养条件为温度26左右，每日光照12小时，光照强度2000lux。 0026 S32. 生根壮苗：选取2 cm以上的芽或小苗，接种于： 1/2MS+ 6-BA 0.10.2 mg L-1 + NAA 0.51.0 mgL-1 + 蔗糖20 -40 gL-1 +卡拉胶7.5gL-1 + AC 0.5 gL-1，的固体培养基上培养。培养条件为温度26左右，每日光照12小时，光照强度20。

25、00lux。 0027 S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，发现粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的根状茎分化形成过程苗的时间长，其试管苗比其他试管苗更粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝，为拟似多倍体（图2-b和图3-b）； S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得： S41. 流式细胞仪鉴定：以试管苗叶片为材料，按Partec-cyview85流式细胞仪操作步骤和流程测定对照（形态正常的试管苗）和拟似多倍体的倍性（图2-c,e和图3-c,e）。 0028 S42. 根尖细胞染色体鉴定：以试管苗幼嫩根尖为材料，采用压片法鉴定拟似多倍。

26、体试管苗和对照根尖细胞染色体数，染色体数为40时为二倍体，染色体为60或以上时为多倍体（图2-d,f和图3-d,f） ; S43. 有性多倍体的获得：当多倍体小苗长至58 cm并具有2条以上根时即可进行炼苗。炼苗时，将培养瓶盖子旋松，放在温室中1020 d或在室外无直射光的地方放置35 d 后，取出试管苗洗净，用树皮和进口泥炭混合基质种植于育苗杯中，按国兰种植的管理方法进行栽培即可获得成品多倍体。 0029 表1国兰有性多倍体发生率 *：（）内数据为该株系（品种）的2n雄配子发生率； 06-bs-45-17和06-bs-45-32分别为小香兔耳兰的高效发生2n雄配子杂交后代。说明书 4/4 页 7 CN 107347627 A 7 图1 说明书附图 1/3 页 8 CN 107347627 A 8 图2 说明书附图 2/3 页 9 CN 107347627 A 9 图3 说明书附图 3/3 页 10 CN 107347627 A 10 。