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一种诱导蒙古莸多倍体的方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-01-16 10:24

一种诱导蒙古莸多倍体的方法与流程

1.本发明涉及林木繁育技术领域，具体涉及一种诱导蒙古莸多倍体的方法。

背景技术：

2.蒙古莸为马鞭草科莸属灌木，是国家级三级珍稀濒危保护物种，具有较高的观赏、生态和药用价值。蒙古莸常自基部即分枝，嫩枝紫褐色，圆柱形。叶片厚纸质，线状披针形或线状长圆形，背面密生灰白色绒毛。聚伞花序腋生，花冠蓝紫色。蒴果椭圆状球形。
3.蒙古莸极耐旱、耐寒，萌蘖性强，耐沙埋，对土壤要求不严，其在疏松渗透性良好的沙壤土生长最佳。能够在降水量200毫米以下地区自然生长，冬季能耐-35℃低温，夏季能耐40℃高温，是优良的生态建设植物。
4.在内蒙古地区，蒙古莸的花果期为7-10月。蒙古莸开花时，大多植物均进入落花期，是稀花季节。且其花色鲜艳美观，具有较高的观赏价值。但其花色单一，使其观赏性降低。因此需要培育蒙古莸多倍体，为选育花色多样、饲用价值高、适应能力强的蒙古莸新材料。
5.鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

6.本发明提供了一种诱导蒙古莸多倍体的方法，该方法对蒙古莸组织培养技术进行了改进，并提出了蒙古莸叶片染色体鉴定的方法。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
8.本发明涉及一种诱导蒙古莸多倍体的方法，包括以下步骤：
9.(1)从蒙古莸上截取茎段，接种于初代培养基中进行初代培养，得到丛生芽；
10.(2)将所述丛生芽接种于增殖培养基中进行预培养，得到嫩茎；
11.(3)将所述嫩茎接种于加入秋水仙素的诱导培养基中进行诱导处理，得到诱导后的茎段；
12.(4)将所述诱导后的茎段转接步骤(2)中所述的增殖培养基中进行增殖培养，得到诱导苗；
13.(5)将所述诱导苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。
14.优选地，步骤(1)中，从蒙古莸上截取茎段的步骤包括：从经播种培育的蒙古莸幼苗上选取幼嫩的茎段，经外植体灭菌后去除两端剪口，将茎段截取为1-2cm长的小段，截取的茎段至少带一个腋芽。
15.优选地，步骤(1)中，将从蒙古莸上截取的茎段垂直插入初代培养基内，使腋芽露出培养基，然后进行初代培养。
16.优选地，步骤(1)中，所述初代培养基以添加琼脂的ms为基础培养基，并添加6-ba、naa和ga3得到，所述初代培养基中6-ba的浓度为1.5mg/l，naa的浓度为0.3mg/l，ga3的浓度为0.02g/l。
17.本发明中采用的ms培养基是目前使用最普遍的培养基，其配方为组培领域公知的。该培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。6-ba为苄氨基腺嘌呤，为人工合成的细胞分裂素，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，6-ba的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。naa为萘乙酸，属于植物生长素，能促进细胞分裂与扩大。在组培中，生长素类的作用是诱导愈伤组织的形成，胚状体的产生以及试管苗的生根。通常将生长素与细胞分裂素配合使用，以诱导腋芽和不定芽的产生。ga3为赤霉素，能促进茎的伸长和诱导长日植物在短日条件下抽薹开花。
18.优选地，步骤(1)中，所述初代培养条件为：从蒙古莸幼苗上截取茎段接种于初代培养基中，在温度为25
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养10～15d。
19.优选地，步骤(2)中，所述增殖培养基以添加琼脂的ms为基础培养基，并添加6-ba和naa得到，所述增殖培养基中6-ba的浓度为0.3mg/l，naa的浓度为0.2mg/l。
20.优选地，步骤(2)中，所述预培养条件为：将所述初代培养获得的丛生芽接种于增殖培养基中，在温度为20
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养7天。
21.优选地，步骤(3)中，所述诱导培养基以不添加琼脂的ms为基础培养基，添加6-ba、naa和秋水仙素得到，所述增殖培养基中6-ba的浓度为0.3mg/l，naa的浓度为0.2mg/l，秋水仙素的浓度为5mg/l。
22.通常诱导培养基为液体培养基，因此其中不加入琼脂。秋水仙素是一种生物碱，又名秋水仙碱。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。自1937年美国学者布莱克斯利(a.f.blakeslee)等，用秋水仙素加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以后，秋水仙素就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种中。在本发明中，加入秋水仙素是为了得到蒙古莸四倍体。
23.优选地，步骤(3)中，所述诱导培养的条件为：将预培养获得的嫩茎接种于诱导培养基中，在温度为25
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养24h。
24.优选地，步骤(4)中，所述茎段经诱导处理后需用无菌水清洗4次，每次1min，无菌滤纸吸干表面水分后，接种于步骤(2)所述的增殖培养基中。
25.优选地，步骤(4)中所述增殖培养的条件为：在温度为25
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养20d以上。
26.优选地，由于诱导培养会产生四倍体、二倍体和嵌合体，因此步骤(4)结束后，需要对诱导苗进行染色体数目分析，确定其染色体数目，筛选出四倍体继续培养20～30d后，进行生根培养。分析仪器为流式细胞仪或显微镜。
27.如采用流式细胞仪，需要截取诱导苗的叶片进行染色体数目分析。流式细胞仪的鉴定速度较快，但误差率较大，需要在流式细胞仪鉴定后再采用显微镜鉴定。
28.优选地，采用显微镜进行染色体数目分析的方法包括：取步骤(4)得到的诱导苗茎段，截取长度为1-2cm的部分转接于增殖培养基中，转接72h后取刚生长出的幼嫩茎尖用于
染色体压片。具体步骤如下：
29.(1)取生长旺盛的幼苗茎尖2-3mm，将茎尖置于浓度为0.002mol/l的8-羟基喹啉溶液中黑暗处理2h；
30.(2)取出茎尖后，用纯净水清洗4次，每次2min，后置于固定液中固定24h，其中在固定12h后换固定液1次。固定液为无水乙醇与冰乙酸的混合液，无水乙醇与冰乙酸的体积比为3:1；
31.(3)从固定液中取出茎尖，用纯净水漂洗4次，每次5min，再置于解离液中常温解离10min。解离液为体积浓度为15％的盐酸与体积浓度为95％的无水乙醇的混合液，两者的体积比为1:1；
32.(4)用蒸馏水漂洗解离后的茎尖4次，每次5min，将茎尖移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1mm左右，以十字压片法覆以载玻片，然后分开两载玻片；
33.(5)在两玻片上各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色，30min后加上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染液；
34.(6)在盖玻片上覆一层吸水纸，然后敲打10min；
35.(7)镜检：先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。
36.优选地，步骤(5)中，所述生根培养基以添加琼脂的ms为基础培养基，并添加iba和naa得到，所述生根培养基中iba的浓度为0.3mg/l或1.0mg/l，naa的浓度为0.5mg/l。
37.优选地，步骤(5)中，所述生根培养条件为：将所述诱导苗接种于生根培养基中，在温度为25
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养15～25天。
38.本发明的有益效果：
39.鉴于蒙古莸种质资源的重要性，且目前有关蒙古莸多倍体培育的技术未见报道，使其种质资源创新及种质的推广应用受到限制。本发明提供了一种诱导蒙古莸多倍体的方法，包括对蒙古莸幼苗选取茎段后进行初代培养，然后进行增殖培养并采用秋水仙素诱导得到多倍体，经过生根培养后得到蒙古莸的多倍体幼苗。
40.进一步地，本发明在进行蒙古莸多倍体培育的同时，对蒙古莸组织培养技术进行了改进，提出蒙古莸染色体鉴定的新方法。
附图说明
41.图1为用流式细胞仪鉴定二倍体中的dna含量图。
42.图2为用流式细胞仪鉴定四倍体中的dna含量图。
43.图3为用显微镜鉴定二倍体中的染色体数量图。
44.图4为用显微镜鉴定四倍体中的染色体数量图。
具体实施方式
45.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
46.实施例
47.1.组织培养体系构建：本次实验仅进行初代培养、增殖培养和生根培养，目的在于探索蒙古莸适宜的组织培养体系。
48.(1)初代培养：从经播种培育的蒙古莸幼苗上选取幼嫩的茎段，经外植体灭菌后去除两端剪口，将茎段截取为1-2cm长的小段，截取的茎段至少带一个腋芽。将从蒙古莸上截取的茎段垂直插入初代培养基内，使腋芽露出培养基，然后在温度为25
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养10～15d，得到丛生芽。
49.初代培养基以添加琼脂的ms为基础培养基，并添加6-ba、naa和ga3得到。初代培养共设置5个处理组，分别为：ms+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l naa(m1)、ms+1.0mg/l 6-ba+0.3mg/lnaa+0.01mg/l ga3(m2)、ms+1.0mg/l 6-ba+0.3mg/l naa+0.03mg/l ga3(m3)、ms+1.5mg/l 6-ba+0.3mg/l naa+0.02mg/l ga3(m4)、ms+0.5mg/l 6-ba+0.5mg/l naa(m5)，每瓶接种5个茎段，每个处理组接种20瓶。不同处理组中蒙古莸丛生芽生长情况详见表1。
50.表1 蒙古莸适宜的初代培养基
[0051][0052]
由表1可知，蒙古莸适宜的初代培养基条件为ms+1.5mg/l 6-ba+0.3mg/lnaa+0.02mg/l ga3，在该条件下，成活率可达84％，玻璃化率为12％。
[0053]
(2)预培养：将步骤(1)得到的丛生芽接种于增殖培养基中，在温度为20
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养7天，得到嫩茎。
[0054]
增殖培养基以添加琼脂的ms为基础培养基，并添加6-ba和naa得到。增殖培养共设置5个处理组，分别为：1/2ms(s1)、ms(s2)、1/2ms+0.5mg/l 6-ba(s3)、ms+0.5mg/l 6-ba+0.5mg/l naa(s4)，ms+0.3mg/l 6-ba+0.2mg/l naa(s5)，每瓶接种茎段3个，每个茎段保留芽2-3个，每个处理组接种10瓶。不同处理组中蒙古莸的分化情况详见表2。
[0055]
表2蒙古莸适宜的增殖培养基
[0056][0057]
由表2可知，蒙古莸适宜的增殖培养基为ms+0.3mg/l 6-ba+0.2mg/l naa，在此条件下，蒙古莸的增殖系数可达14.2，且其茎段粗壮，生长健壮。
[0058]
(3)生根培养：将步骤(2)得到的嫩茎接种于生根培养基中，在温度为25
±
2℃，每
天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养15～25天，得到生根苗。
[0059]
生根培养基以添加琼脂的ms为基础培养基，并添加iba和naa得到。生根培养共设置4个处理组，分别为：ms+0.5mg/l iba+0.5mg/l naa(g1)、ms+0.3mg/l iba+0.5mg/l naa(g2)、ms+1.0mg/l iba+0.5mg/l naa(g3)、ms+0.3mg/l iba+0.3mg/l naa(g4)，每瓶转接幼苗5株，每个处理组转接10瓶。不同处理组中蒙古莸的生根情况详见表3。
[0060]
表3 蒙古莸适宜的生根培养基
[0061][0062]
由表3可知，蒙古莸较易生根，在各处理组中生根率均较高。在ms+0.3mg/l iba+0.5mg/l naa和ms+1.0mg/l iba+0.5mg/l naa处理下，根数较多且粗壮。
[0063]
因此，结合以上结果，蒙古莸适宜的组织培养体系为：初代培养基：ms+1.5mg/l 6-ba+0.3mg/l naa+0.02mg/l ga3；增殖培养基：ms+0.3mg/l 6-ba+0.2mg/l naa；生根培养基：ms+0.3mg/l iba+0.5mg/l naa和ms+1.0mg/l iba+0.5mg/l naa。
[0064]
2.蒙古莸多倍体适宜诱导条件探索
[0065]
采用上述的初代培养和预培养方法得到蒙古莸嫩茎。将嫩茎接种于加入秋水仙素的诱导培养基中，在温度为25
±
2℃，每天光照时间为8h，光照强度为2500xl的条件下培养24h，得到诱导后的茎段。
[0066]
诱导培养基以不添加琼脂的ms为基础培养基，添加6-ba、naa和秋水仙素得到。诱导培养共设置27个处理组，每个处理组转接诱导茎段20瓶，每瓶5个。蒙古莸诱导培养条件及其结果详见表4。
[0067]
表4 蒙古莸多倍体适宜诱导条件
[0068][0069]
依据试验结果，以上诱导处理条件下材料均产生严重褐化现象，仅在秋水仙素浓度为20mg/l的条件下有部分诱导苗产生，对产生的诱导苗经鉴定无四倍体。因此该诱导条件不适合蒙古莸材料。进而调整秋水仙素浓度如表5所示：
[0070]
表5 蒙古莸多倍体适宜诱导条件补充
[0071][0072]
由表5可知，在秋水仙素浓度为3mg/l时，诱导苗获得率较高；但在秋水仙素浓度为5mg/l，预培养7d，诱导培养1d时，其四倍体获得率最高，为15％；其次在秋水仙素浓度为3mg/l，预培养0d，诱导培养1d或2d时四倍体获得率较高为13％。在以上诱导条件下，秋水仙素浓度为3mg/l，预培养0d，诱导培养1d或2d时嵌合体获得率较高，分别为23％和13％，高于秋水仙素浓度为5mg/l，预培养7d，诱导培养1d时的处理。
[0073]
因此，综合以上分析，秋水仙素浓度为5mg/l，预培养7d，诱导1d是蒙古莸四倍体诱导的最适条件。
[0074]
3.蒙古莸茎尖染色体鉴定方法
[0075]
3-1流式细胞仪鉴定
[0076]
在超净工作台内，从上述诱导处理得到的诱导苗上剪取1～2片叶子，标记后用流式细胞仪鉴定倍性。筛选出四倍体继续培养20～30d后，进行生根培养。
[0077]
图1和图2分别是二倍体和四倍体中的dna含量图，说明采用秋水仙素诱导能够得到四倍体，但也存在未发生染色体数目变化的二倍体。图中纵坐标为粒子数，横坐标为dna含量。
[0078]
3-2显微镜鉴定
[0079]
取上述诱导处理得到的诱导苗茎段，截取长度为1-2cm的部分转接于增殖培养基
中，转接72h后取刚生长出的幼嫩茎尖用于染色体压片。具体步骤如下：
[0080]
(1)取生长旺盛的幼苗茎尖2-3mm，将茎尖置于浓度为0.002mol/l的8-羟基喹啉溶液中黑暗处理2h；
[0081]
(2)取出茎尖后，用纯净水清洗4次，每次2min，后置于固定液中固定24h，其中在固定12h后换固定液1次。固定液为无水乙醇与冰乙酸的混合液，无水乙醇与冰乙酸的体积比为3:1；
[0082]
(3)从固定液中取出茎尖，用纯净水漂洗4次，每次5min，再置于解离液中常温解离10min。解离液为体积浓度为15％的盐酸与体积浓度为95％的无水乙醇的混合液，两者的体积比为1:1；
[0083]
(4)用蒸馏水漂洗解离后的茎尖4次，每次5min，将茎尖移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1mm左右，以十字压片法覆以载玻片，然后分开两载玻片；
[0084]
(5)在两玻片上各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色，30min后加上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染液；
[0085]
(6)在盖玻片上覆一层吸水纸，然后敲打10min；
[0086]
(7)镜检：先在低倍镜(放大倍数为20倍)下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜(放大倍数为100倍)仔细观察、记数和拍照。图3和图4分别是二倍体和四倍体中的染色体数量图，其中二倍体中的染色体数目为26条，四倍体中的染色体数目为52条，说明通过以上方法成功获得蒙古莸四倍体。
[0087]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。