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基于共进化网络信息提高土曲霉转氨酶热稳定性的研究

来源：花匠小妙招时间：2025-02-25 14:41

基于共进化网络信息提高土曲霉转氨酶热稳定性的研究

【摘要】： 转氨酶是一种立体选择性高、反应条件温和的生物催化剂,可以通过不对称合成和动力学拆分法制备手性药物的中间体。随着手性药物市场的不断扩大,转氨酶的工业生产上有着巨大的潜力和广阔的应用前景。然而自然界大部分存在的转氨酶热稳定性较差,严重限制了它们在工业生产中应用。提高酶的热稳定性不仅是转氨酶蛋白质工程具有挑战性的工作,也是转氨酶应用于工业生产亟需解决的难题。本文以来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的R-ω-转氨酶为对象,借助生物信息学在线工具对其同源蛋白序列比对分析,生成了转氨酶残基间的共进化网络,采用信息论方法分析了共进化网络中的相关联残基,对四个度量参数设定阈值,获得了由8个氨基酸残基组成的子网络。在此基础上对预测的8个氨基酸残基进行丙氨酸扫描构建突变体库,测定了8个不同的突变体酶的比活力,其中突变体L118A的比活力是野生型的2.57倍。稳定性分析结果表明,突变体L118A的解折叠温度(T_m)和半失活温度(T_(50)~(10))相比于野生型分别提高2.1°C和3.7°C,40°C时的半衰期(t_(1/2))较野生型延长了13.7 min。针对L118位点设计了简并引物,构建饱和突变文库。以热处理后酶残余百分比高于野生型为筛选指标,随机筛选300个突变体,获得稳定的突变体L118T。酶的热稳定性分析结果显示,突变体L118T的T_m和T_(50)~(10)相比于野生型分别提高5.0°C和5.3°C,40°C时的t_(1/2)较野生型延长了19.2 min。同时对突变体进行了动力学参数测定,发现突变体L118T对底物丙酮酸和(R)-α-甲基苄胺的催化效率都有很明显的提高。通过对突变酶不对称合成反应的分析,发现由118位点的亮氨酸替换成苏氨酸的突变体不会改变转氨酶的立体选择性。经过分子动力学模拟分析,发现整个模拟过程突变体L118T的均方根偏差(Root mean square deviation,RMSD)比野生型低,表明其结构刚性增强;突变体结构中残基Val170-Gly190的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)低于野生型,表明突变体L118T的这些残基具有更稳定的构象。以最稳定的突变体L118T为模板,联合子网络中其它相关残基组成3个组合L118T-F115、L118T-N181和L118T-W184,进行新一轮饱和突变,构建了3个迭代饱和突变文库,从中筛选出更稳定的双突变L118T-F115L。酶的热稳定性分析结果显示,双突变L118T-F115L的T_m和T_(50)~(10)相比于野生型分别提高7.7°C和8.8°C,40°C时的t_(1/2)较野生型延长了59.0 min。分子动力学模拟分析发现L118T-F115L的RMSD要比野生型低,突变使其结构刚性增强。通过分析转氨酶分子内共进化网络,应用信息论的方法指导预测共进化网络中高交联残基位点,指导转氨酶的分子改造,较为高效地提高了转氨酶的热稳定性。该研究不仅为手性胺的合成提供优良的生物催化剂,而且为提高其他酶的热稳定性和催化效率提供方法学指导。

【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019

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