基于生物计算对SMG1和PCL脂肪酶热稳定性改造的应用基础研究

【摘要】： 偏甘油酯脂肪酶(mono-and di-acylglycerol lipase(DGL))在油脂和化工行业中具有重要应用价值。但是,目前报道的DGL都属于中温酶,严重限制了其工业应用,需要对其热稳定性进行改造。本论文以偏甘油酯脂肪酶SMG1和PCL为研究对象,通过计算生物学方法开展热稳定性改造。具体包括以下几个方面的内容:1.运用计算机辅助设计对脂肪酶SMG1的热稳定性研究。运用三种软件RosettaDesign、FoldX和ABACUS对SMG1进行热稳定性突变设计,最后得到18个Tm值提高的单点突变;将上述18个单点突变位点叠加组合,得到最佳突变体S5(Q34P+A37P+M176V+G177A+M294R),其Tm值提升6℃,最适温度提高5℃;在S5的基础上,进行了二轮设计,得到Tm值提升6℃的单点Q282F,酶活性测定发现该突变体对酶活性影响显著,基于结构分析,可知突变后的氨基酸位点形成空间位阻,并且与F278形成的π-π相互作用也会造成空间位阻。2.氨基酸替换结合结构分析对脂肪酶PCL的热稳定性改造。基于计算生物学方法获得的微生物热稳定蛋白质的氨基酸组成特征,通过将脂肪酶PCL的氨基酸组成与其进行比较,选择将PCL中的氨基酸A、D、S和T突变为E、K、R、I和L,得到93个候选的突变体;与同源性的热稳定脂肪酶进行序列比较分析,并比较分析了亲疏水氨基酸分布特征,将候选突变体减少到28个;相互作用力得到突变体PCL-D25R。构建突变体,发现PCL-D25R的Tm值比PCL-WT提高了3℃,最适温度提高了5℃,在45℃的t_(1/2)值高了4倍,动力学分析发现突变体PCL-D25R中有盐桥形成,增加了蛋白的稳定性。3.比较分析和总结两种蛋白质热稳定性改造方法。比较分析两种酶热稳定性改造方法,可知计算机辅助蛋白质稳定性设计方法较全面,但是后期需要构建的突变体库较大,实验周期也更长。基于计算生物学方法总结热稳定蛋白氨基酸组成特征,采用氨基酸替换方法构建一个虚拟突变体库,再结合序列同源性和结构分析,可以有效的降低需要构建的突变体数量,具有成为基于脂肪酶生化特性进行酶类理性改造的新探索。

【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018

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