Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶热稳定性提高的研究

【摘要】： 谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)催化酰基转移反应,促使含伯胺与谷氨酰胺的蛋白质或小分子发生交联。基于该催化反应,TGase在食品、纺织和医药等领域展现出极大的应用前景。但较差的热稳定性严重影响了TGase的应用效果。本研究以Streptomyces hygroscopicus WSH03-13 TGase的稳定突变体P132I为研究对象,通过随机突变提高其热稳定性,同时考察了小分子热休克蛋白(Small heat shock proteins,sHSPs)及不同稳定剂配方对酶稳定性的影响。本论文主要结果如下:(1)随机突变提高TGase热稳定性利用易错PCR对TGase基因进行随机突变,从4500个TGase突变体中筛选得到8株热稳定性提高的突变体2-9C、1-3D、5-2E、1-8H、6-7D、6-5G、6-2E和3-12G,并经镍柱亲和纯化。与P132I相比,突变体3-12G的50℃半衰期(t_(1/2))为10.04 min,较P132I提高100.80%,其它突变体提高20.20%-82.40%。此外,突变体3-12G和6-2E的比酶活较P132I分别提高15.57%和7.39%。TGase分子内作用力分析表明,大部分突变体的作用力均增加,其中突变体3-12G的突变位点较P132I增加一个氢键,酶分子间作用力的增加可能是突变体热稳定性提高的原因之一。(2)sHSPs对TGase热稳定性的影响将Escherichia coli JM109来源的sHSPs IbpA和IbpB表达于E.coli BL21(DE3),经镍柱亲和纯化得到纯蛋白。按不同比例将sHSPs与3-12G与混合,考察前者对后者热稳定性的影响。结果显示,添加IbpA对TGase的稳定效果不明显;添加IbpB(500μg·m L~(-1),终浓度)使3-12G(50μg·m L~(-1),终浓度)的t_(1/2)(50℃)提高至16.33 min,较不添加稳定剂的酶(对照)提高62.65%;混合添加sHSPs(500μg·m L~(-1),总浓度)使3-12G的t_(1/2)(50℃)较对照提高95.42%,达到19.62 min。透射电镜分析显示,热处理条件下,sHSPs与3-12G的混合液形成较大颗粒,而3-12G不能。上述结果表明,sHSPs与3-12G形成聚合物可能是TGase热稳定性提高的原因。此外,使用不同长度的柔性连接肽连接sHSPs和TGase,发现融合蛋白不能提高TGase的热稳定性。(3)常规稳定剂提高TGase的热稳定性对常规酶稳定剂进行筛选和组合,考察酶稳定剂组成对TGase热稳定性的影响。结果显示,40 g·L~(-1) NaCl、50 g·L~(-1)山梨醇、50 g·L~(-1)葡萄糖和50 g·L~(-1)小麦蛋白使3-12G(50μg·mL~(-1),终浓度)的t_(1/2)(50℃)较对照分别提高7.94、2.66、2.74和9.58倍,达到89.79 min、36.71 min、37.52 min和106.22 min。基于上述稳定剂设计正交试验,得到TGase最佳稳定剂组合为:小麦蛋白50 g·L~(-1)、NaCl 50 g·L~(-1)、葡萄糖50 g·L~(-1)和山梨醇50 g·L~(-1)。在该稳定剂条件下,3-12G的t_(1/2)(50℃)达到331.50 min,较对照提高31.97倍;常温储存60天,3-12G的残余酶活达到66.49%,较对照提高17.07倍。

【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018

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