首页分享一种基于微滴式数字PCR技术的南方根结线虫引物探针组合和检测方法技术

一种基于微滴式数字PCR技术的南方根结线虫引物探针组合和检测方法技术

来源：花匠小妙招时间：2025-01-05 14:53

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基于微滴式数字PCR技术的南方根结线虫引物探针组合和检测方法。包括引物对和探针；所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术应用微滴式数字PCR技术检测南方根结线虫，与重复性较差的RAPD技术、核糖体DNA限制性内切酶技术检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的南方根结线虫检测技术。该技术可应用于对南方根结线虫田间土壤样品及南方根结线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种基于微滴式数字pcr技术的南方根结线虫引物探针组合和检测方法。

技术介绍

1、根结线虫(meloidogyne spp.)是一种危害作物生长的植物病原线虫，在世界范围内广泛存在，其寄主范围广，可侵染园林、花卉、大田作物等3000多种植物。根结线虫主要危害植物根部，造成侧根和根毛病变畸形，使植株生长缓慢，发育不良；后期受害严重时，植株下部会整株枯死。除了直接为害植株外，根结线虫侵入寄主根部时留下的伤口，为其他土壤病原菌提供了侵入的机会，造成根结线虫和其他病原菌的联合侵染，从而加重对寄主的伤害。每年造成全球作物产量损失10％～25％，造成经济损失1000亿美元以上，已经成为制约农作物产量的重要因素。

2、迄今为止，全世界报道的根结线虫约100种，其中南方根结线虫(m.incognita)是分布最广、危害最严重的4种常见根结线虫之一。在我国南方热带及亚热带地区，由于温度较高，线虫无需休眠越冬，导致根结线虫的发生非常普遍，其中南方根结线虫和象耳豆根结线虫的危害最为严重。研究发现，黄伟明等人发现海南省11个县市葫芦科蔬菜主产区根结线虫病的发病率均高于50％，部分地区达100％，经鉴定南方根结线虫占总数的一半以上，是危害海南葫芦科蔬菜的优势种。

3、随着时代和科技的不断发展，根结线虫的检测鉴定方法从传统的单一形态学分类鉴定，逐步演化到以dna为基础的分子生物学检测鉴定，使得根结线虫的检测鉴定结果更加快速和准确。

4、限制性内切酶片段长度多态性(restriction

5、微滴式数字pcr技术(droplet digital pcr,ddpcr)是继rt-qpcr之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术。ddpcr作为一种新兴技术:与传统pcr技术相比，它已经由定性检测升级为绝对定量检测；与qpcr技术相比,ddpcr技术不依赖于标准曲线，它具有非常高的准确性和灵敏度，而且提高了对pcr反应抑制物的耐受度。目前，在检测根结线虫的研究中，该技术已成功应用于象耳豆根结线虫的精准定量检测。

6、目前暂无南方根结线虫的特异性taqman探针和微滴式数字pcr技术特异性检测南方根结线虫的报道。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种基于微滴式数字pcr技术的南方根结线虫引物探针组合和检测方法，建立微滴式数字pcr快速分子检测方法及其应用，为南方根结线虫的快速分子检测、早期诊断和辅助鉴定南方根结线虫等服务。

2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：

3、本专利技术提供了一种基于微滴式数字pcr技术的南方根结线虫引物探针组合，包括引物对和探针；

4、所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

6、所述探针的核苷酸序列如seq id no.3所示。

7、本专利技术提供了一种检测南方根结线虫的试剂盒，包括上述技术方案所述的南方根结线虫引物探针组合。

8、优选的，所述试剂盒还包括探针法ddpcr反应预混液。

9、本专利技术还提供了一种检测南方根结线虫的方法，包括以下步骤：

10、1)提取样品的基因组dna，以所述基因组dna为模板经上述技术方案所述的南方根结线虫引物探针组合进行微滴生成和扩增，得到扩增产物；

11、2)将所述步骤1)得到的扩增产物通过droplet reader微滴读取仪读取数据，使用quantasofttmanalysis pro software进行数据分析，检测到含有vic荧光信号的阳性微滴时，表明样品为南方根结线虫。

12、优选的，所述步骤1)扩增的体系为：探针法ddpcr反应预混液11μl、浓度为10μm的上下游引物各1.98μl、浓度为10μm的探针0.55μl、基因组dna1.1μl，ddh2o至22μl。

13、优选的，所述扩增的程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，53.8℃退火1min，40个循环；98℃孵育10min。

14、本专利技术还提供了上述技术方案所述的南方根结线虫引物探针组合或上述技术方案所述的试剂盒在检测南方根结线虫中的应用。

15、本专利技术的有益效果为：

16、本专利技术应用微滴式数字pcr技术检测南方根结线虫，与重复性较差的rapd技术(rapd-pcr)、核糖体dna限制性内切酶技术(rflp-pcr)检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的南方根结线虫检测技术。该技术可应用于对南方根结线虫田间土壤样品及南方根结线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于微滴式数字PCR技术的南方根结线虫引物探针组合，其特征在于，包括引物对和探针；

2.一种检测南方根结线虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的南方根结线虫引物探针组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针法ddPCR反应预混液。

4.一种检测南方根结线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)扩增的体系为：探针法ddPCR反应预混液11μl、浓度为10μM的上下游引物各1.98μl、浓度为10μM的探针0.55μl、基因组DNA 1.1μl，ddH2O至22μL。

6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，53.8℃退火1min，40个循环；98℃孵育10min。

7.权利要求1所述的南方根结线虫引物探针组合或权利要求2所述的试剂盒在检测南方根结线虫中的应用。

【技术特征摘要】

1.一种基于微滴式数字pcr技术的南方根结线虫引物探针组合，其特征在于，包括引物对和探针；

2.一种检测南方根结线虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的南方根结线虫引物探针组合。