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植物病原分子检测技术

来源：花匠小妙招时间：2024-11-24 11:56

—137—技术与应用植物病原分子检测技术刘秀丽陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳745000【摘要】对植物病菌检测的分子生物学方法主要有PCR技术、限制性片段长度多态性RestrictionFragmentLengthPolymorphism简称RFLP技术、核酸杂交技术、基因芯片技术、SSR分子标记技术、随机扩增多态性DNARandomlyAmplificationPolymorPhicDNARAPD技术。【关键词】植物病原分子检测PCR随着人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深以现代分子生物学为基础的应用实例——分子生物学检测技术应运而生可以说它是生物学理论与实践完美结合的最有利的证明。自从上个世纪八十年代以来分子生物学技术并结合其他辅助技术如计算机分析技术等在社会各个领域得到了广阔的发展和应用。在此前提下真菌、细菌在种及种以下的分类学及病原检测方面的研究也深入到了分子水平只看植物病菌检测方面其准确性和灵敏度以及检测的特异性都得到了大大提高[1]目前植物病源检测的分子生物学方法主要有以下几种1PCR技术PCR技术是上个世纪80年代中期发明的一项体外大量克隆目标基因序列的技术。PCR反应能够在微量离心管中进行加入适量的缓冲液微量的模板DNA四种脱氧单核苷酸耐热性聚合酶一对合成DNA的引物通过高温变性、低温退火和中温延伸重复循环多次就可获得放大几百万倍的目标基因。可以说任何DNA或者RNA序列只要对某个物种是高度特异的就可以用PCR技术去检测该物种。目前比较常用的有实时荧光定量PCRReal-timeuorescentPCR巢式PCRNestPCR反转录PCRReversetranscriptionRT-PCR多重PCRmPCR等。实时荧光PCR是在PCR体系中加入荧光染料或探针通过检测积累的荧光信号进行实时监测PCR反应进程从而进一步对样品初始浓度进行定量分析。例如番茄溃疡病菌[2]、香蕉枯萎细菌性病菌[3]、西瓜细菌性果斑病菌[4]等细菌的检测。巢式PCR一般是指以第一轮PCR扩增产物为模板根据目标序列内部设计的另一对引物再进行第2次扩增该方法一般针对那些引物特异性较差、或者一轮PCR反应产物较少的病原检测而设计的。该方法进行植物病菌的检测已有成功的报道例如葡萄病毒[5]的病毒株的鉴定向日葵白锈病菌[6]等细菌的检测。RT-PCR是指先将RNA通过反转录酶的作用反转录为cDNA然后以cDNA为模板进行PCR扩增的技术。在对植物病毒检测中成功的报道很多包括马铃薯病毒[7]、葡萄病毒[8]、兰花病毒[9]、百合病毒[10]等很多植病毒病害的检测。多重PCRMultiplexPolymeraseChainReactionmPCR是指针对不同的目标序列在同一个PCR扩增体系中加入两对或两对以上的特异性引物,扩增出多个不同大小的核酸片段[11]。2005年Kawasaki等[12]应用多重PCR技术同时检测食品中的沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌检测敏感性可达1CFU/25g。2RFLP技术1974年Grodjicker等人首次提出限制性片段长度多态性RestrictionFragmentLengthPolymorphism简称RFLP技术[13]。其基本原理是因为不同生物个体具有自己独特的DNA序列特征因此在其DNA序列上就具有了不同的限制性内切酶的酶切位点用相应内切酶进行酶解消化就会在不同个体之间产生不同长度的DNA片段这种DNA片段的多态性称为限制性片段长度多态性RFLP。自从20世纪80年代PCR发明与RFLP结合后使RFLP技术更加简便快捷目前该技术已得到广泛使用[14]。3核酸杂交技术核酸杂交技术是一项典型的分子生物学技术主要通过对特定序列的检测来确定样品中DNA或RNA分子的存在。首先将待检DNA或者RNA转移并固定住在硝酸纤维素膜或尼龙膜上然后用标记过的单链DNA或RNA探针与其杂交,探针通过氢键与其互补的靶序列结合经放射性自显影或显色反应检测特异结合的探针从而获取样本中特定DNA的含量[15]。因杂交反应通常在一种特定的膜上进行因此又把它称为核酸印迹杂交。1989年Johansen等人[16]使用32P标记dCTP的DNA杂交探针技术检测了马铃薯环腐病细菌可检测出0.5ng总DNA。4基因芯片技术基因芯片又称DNA芯片DNAchip。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上与标记的待测样品进行多位杂交通过杂交信号的强弱及分布来分析目的分子的有无、数量及序列从而获得受检样品的遗传信息。其工作原理与经典的核酸分子杂交一致都是利用碱基互补的原则使已知核酸序列与靶序列杂交根据杂交信号进行定性与定量分析。基因芯片能够同时平行分析数万个基因进行高通量筛选与检测分析解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足。5SSR分子标记技术1952年Hamade发现了简单重复序列simplesequencerepeatSSR亦称微卫星。SSR的产生是在DNA复制或修复过程中DNA移动和错配或者细胞分裂期姐妹染色体单位不均等交换的结果。不同遗传材料重复次数的不同导致了SSR长度的高度变异性这一变异性正是SSR标记产生的基础。SSR普遍存在真核和原核生物中具有物种特异性可为植物病原菌鉴定和特异性检测提供丰富的标记来源。SeishiAkino等[17]用微卫星标记Pi26能快速区分5种日本马铃薯晚疫病的基因型。刘帆等[18]用法国农科院开发的12对引物对中国小麦条锈菌主要流行小种及致病类型进行了分析结果表明采用RJ18引物获得了CY32的特异标记进一步建立了我国小麦条锈菌生理小种的分