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可可花瘿病菌酶介导双重指数扩增核酸检测技术快速检测方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-11-29 12:48

本发明属于生物，具体涉及可可花瘿病菌酶介导双重指数扩增核酸检测技术快速检测方法。

背景技术：

1、可可花瘿病菌(albonectria rigidiuscula)属真菌界(fungi)、子囊菌门(ascomycota)、粪壳菌纲(sordariomycetes)、肉座菌目(hypocreales)、丛赤壳科(nectriaceae)、白壳属(albonectria)，目前已被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，是一种检疫性有害真菌。可可花瘿病菌的寄主范围广泛，可危害可可、杧果、毛叶枣、榴莲、玉米、罗汉松、豆科植物等多种植物，造成枝条溃疡、花序枯萎及维管束坏死等症状，在花芽、茎基和枝条等侵染部位可形成癌肿，造成植物萎蔫、畸形或顶枯。可可花瘿病菌广泛分布于亚洲、非洲、北美洲、南美洲、大洋洲等多个国家和地区。

2、近些年来，分子生物学方法在植物病原菌检测方面起了至关重要的作用，常见的有qpcr、lamp、rca等。由于qpcr需要复杂的温度变化过程，因此它对仪器要求较高，阻碍了它的应用范围；lamp则存在非特异扩增的缺点；近些年来发展的重组酶介导核酸扩增(raa)和重组酶聚合酶扩增(rpa)技术则存在低温(37℃-42℃)扩增的优势，并且仅需10-20min即可观测到结果，其整个过程快速高效、操作简单，设备成本低廉，能较好地替代qpcr。而本发明使用的试剂盒采用的酶介导双重指数扩增核酸检测技术(emdea)有机整合了核酸指数扩增及信号指数放大于一管反应，可在20分钟恒温条件下稳定检出单拷贝级别目标核酸，兼具raa和rpa的优势且试剂盒可在4℃中稳定保存，极具走进下沉场景的潜力。本研究基于emdea技术，拟建立一种针对可可花瘿病菌的简便、快速的方法，并确定其在实际样品中的检测效果，满足口岸日常检测和实地监测的需求。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏、特异地检测可可花瘿病菌。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测可可花瘿病菌的试剂盒，所述试剂盒包括检测可可花瘿病菌的组合物，所述组合物包括引物f3、引物r6和rna探针，所述引物f3的核苷酸序列可如seq id no.3所示，所述引物r6的核苷酸序列可如seq id no.11所示，所述rna探针的核苷酸序列可如seq id no.12所示。

3、上述试剂盒中，所述rna探针的5’端可标记报告基团，3’端可标记猝灭基团。

4、所述报告基团选自fam、vic、hex、tet、cy3、cy5、rox、joe、fitc、ned、tamra、lcred640、lc red705、quasar705和texas red。

5、所述猝灭基团选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb和dabcy1。

6、上述试剂盒中，所述报告基团可为fam，所述猝灭基团可为bhq1。

7、进一步地，所述试剂盒还包括酶介导双重指数扩增核酸检测技术所需要的检测试剂。

8、进一步地，所述酶介导双重指数扩增核酸检测技术所需要的检测试剂包括基础干粉和激活剂。所述基础干粉包括检测所需酶：dna重组酶、虾碱性磷酸酶、t7 rna聚合酶、逆转录酶和信号放大酶的冻干产物及冻干保护剂。所述激活剂可为ntp(核苷三磷酸)和缓冲液。

9、进一步地，所述试剂盒还可包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂用于提取来自受试者的生物样品(待测样品)中的核酸。

10、所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。

11、进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测可可花瘿病菌的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、cd等)。

12、所述试剂盒可为基于酶介导双重指数扩增核酸检测技术(emdea)的检测试剂盒。

13、本发明还提供了所述试剂盒在检测可可花瘿病菌中的应用。

14、本发明还提供了检测可可花瘿病菌的组合物，所述组合物可为本文中任一所述的组合物。

15、本发明还提供了所述组合物在检测可可花瘿病菌中的应用。

16、本发明还提供了所述组合物在制备用于检测可可花瘿病菌的产品中的应用。

17、本文所述产品选自试剂、试剂盒、芯片、试纸或检测卡。

18、本发明还提供了一种检测可可花瘿病菌的方法，所述方法包括使用本文中任一项所述的试剂盒或所述组合物对待测样品进行扩增反应，根据扩增结果确定待测样品是否含有可可花瘿病菌或是否为可可花瘿病菌，所述扩增反应是基于酶介导双重指数扩增核酸检测技术进行。

19、进一步地，所述方法包括如下步骤：

20、a1)提取待测样品dna；

21、a2)以所述待测样品dna为模板，利用本文中任一所述的组合物进行酶介导双重指数扩增核酸检测，形成扩增曲线；

22、a3)根据ct值判断检测结果。

23、进一步地，a2)中所述检测的方法包括：在基础干粉(含有dna重组酶、虾碱性磷酸酶、t7 rna聚合酶、逆转录酶和信号放大酶的冻干产物及冻干保护剂)中加入所述组合物(引物f3、引物r6和rna探针(seq id no.12))、ddh2o、模板dna、激活液(ntp(核苷三磷酸)和缓冲液组成的溶液)，进行酶介导双重指数扩增核酸检测反应。

24、进一步地，a2)中进行酶介导双重指数扩增核酸检测的反应条件可为：荧光定量pcr仪温度设置为42℃，1min进行一个循环，每个循环进行一次信号采集。

25、进一步地，所述a3)为：基线期设置为第1个循环开始，第2个循环结束，在30个循环内机器检测到若无ct值则判定检测结果为阴性，若有ct值出现则判定检测结果为阳性。

26、进一步地，所述ct值越小、峰值越大则认定检测效果越好或dna浓度越高。

27、本文所述待测样品可为疑似受感染种苗、菌株及其他受病菌侵染植物产品等。

28、随着分子生物学技术的发展，dna序列分析技术被广泛应用于真菌分类和鉴定中。其中its序列应用最为广泛，但是由于一些真菌类群平均its片段小于有效进行dna条形码的最优片段临界值，同时对于物种相对丰富的子囊菌类群来说，its片段还存在变异性不足，分辨率不够高的缺点。研究表明，可可花瘿病菌及其近似种的its、28s序列差异较小，无法准确划分可可花瘿病菌。

29、目前，行标中对可可花瘿病菌的检疫鉴定标准主要为分离培养法和致病性测定，主要通过对寄主进行分离并对疑似可可花瘿病菌的菌株进行纯化观察并接种到宿主上观察是否发病从而确定。但是传统分离培养法的培养时间耗时较长，影响后续的处理过程，可能会造成巨大的人力损失和经济损失，同时传统分离法容易分离出大量杂菌，影响实验结果，对实验操作人员的要求较高。也有学者运用实时荧光pcr检测可可花瘿病菌，大量减少了检测时间，但对实验条件要求较高，需要有较好的实验仪器。而通过emdea法进行检测可将检测时间缩短至0.5h，耗时短，所需实验器材少，可满足不同条件下的检测要求，极大节约了人力和物力，并且由于该法试剂盒可置于4℃保存，保存条件较为简便，因此可适用于实地检测。

30、可可花瘿病菌(albonectria rigidiuscula)是我国进境检疫性有害生物。本发明通过对可可花瘿病菌ef-1α片段的分析，设计了多个酶介导双重指数扩增核酸检测技术pcr引物和探针，并通过对引物和探针的交叉实验，筛选确定出了emdea法的效果最佳的引物探针组合，并建立了可可花瘿病菌的emdea法快速检测方法。通过灵敏度试验，确定了最低检测限度为20μl反应体系中总dna含量10.00pg。本发明的检测方法具有较好地特异性，实际样品检测效果好，具有良好的稳定性和可重复性，操作简便，实验条件要求较低，耗时较短，适用于口岸日常进出口检测及外出实地监测需求，具有较好的应用前景。