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高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法

来源：花匠小妙招时间：2024-11-23 11:46

摘要：本发明公开一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测新方法，该方法包括两个部分：逆转录反应，即将RNA逆转录为cDNA，和FEN1辅助的RPA扩增检测反应，即高灵敏度的RPA扩增反应偶联高特异性的核酸侵入反应，简称FARPA，通过在逆转录引物上引入RPA通用引物的序列合成cDNA二链，再采用通用引物进行多重RPA扩增，并偶联FEN1催化的级联核酸侵入反应同时检测多重扩增产物。本发明的新方法准确、灵敏度高、特异性好，可以在50分钟内同时检测多种RNA核酸靶标，非常适用于SARS‑CoV‑2及其他RNA病毒的快速检测，在病原体核酸检测中具有很高的应用价值。

权利要求：

1.一种高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于其步骤包括： (1)逆转录反应：以待测样品为模板，加入一对逆转录引物进行逆转录反应，获得cDNA二链，所述逆转录引物由5′端的RPA通用引物序列和3′端的核酸靶标特异性序列两部分组成； (2)多重RPA扩增反应，并偶联级联核酸侵入反应：以cDNA二链为模板，加入一对RPA通用引物、上游探针、下游探针、发夹探针，在酶的作用下，控制温度先进行多重RPA反应以扩增核酸模板，再提高温度进行级联核酸侵入反应；所述的上游探针其3′末端最后一个碱基与核酸靶标错配，其余的序列与核酸靶标互补，并且熔解温度高于核酸侵入反应的温度，与互补的核酸靶标稳定地结合；所述的下游探针其5′端有一段与核酸靶标不互补的翘起序列，称为flap片段，其余的序列与核酸靶标互补，并且熔解温度接近核酸侵入反应的温度，在核酸侵入反应中能与核酸靶标结合和解离；所述的发夹探针是具有荧光共振能量转移的探针，其5′端修饰了荧光基团和淬灭基团，且两者间隔1～6个碱基，flap核酸内切酶的识别位点在间隔碱基上，其3′端序列与不同下游探针对应的flap片段互补，用于检测不同的核酸靶标。 2.根据权利要求1所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：步骤(2)中使用的酶为DNA聚合酶、重组酶、flap核酸内切酶，还包括单链DNA结合蛋白。 3.根据权利要求1或2所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：荧光基团为FAM、VIC或Cy5，淬灭基团为BHQ1或BHQ2。 4.根据权利要求1或2所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：所述flap核酸内切酶为Afu FEN1，具有单碱基差异的识别能力，能够特异性地识别并切割由上游探针、下游探针和核酸靶标形成的三碱基重叠结构，或flap片段与发夹探针形成的三碱基重叠结构。 5.根据权利要求1或2所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中使用HiScriptⅡ或PrimeScriptⅡ逆转录酶进行逆转录反应，同时还添加有TaqDNA聚合酶和RNase抑制剂。 6.根据权利要求1或2所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中逆转录反应条件为50℃6min，95℃1min，55℃1min，72℃1min。 7.根据权利要求1或2所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：步骤(2)中的DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA恒温扩增聚合酶，所述的重组酶为T4 UvsX和T4 UvsY蛋白，所述的单链DNA结合蛋白为T4 gp32蛋白。 8.根据权利要求1或2所述的高灵敏高特异的多重RNA病毒核酸检测方法，其特征在于：步骤(2)中多重RPA反应的温度为37～42℃，时间为10～30min；步骤(2)中级联核酸侵入反应温度为60～63℃，时间为1～20min。