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番茄花叶病毒外壳蛋白与烟草IP

来源：花匠小妙招时间：2026-02-19 18:10

学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示作　者: 李婷婷
导　师: 孙现超
学　校: 西南大学
专　业: 植物病理学
关键词: 番茄花叶病毒外壳蛋白 IP-L 双分子荧光互补
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 13次
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内容摘要

番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的成员之一,基因组为单链正义RNA,大小约为6.4kb,编码了3个非结构蛋白和17.6kDa的外壳蛋白(coat protein, CP)。通过汁液机械摩擦传播及种子带毒传播,番茄是其主要的寄主,对番茄的品质和产量造成了严重的影响。该病毒与寄主相互作用的机制尚不完全清楚。与外壳蛋白互作的蛋白IP-L (CP-interacting protein-L, IP-L)是在烟草体内发现的可以与ToMV CP在体内互作的蛋白,ToMV CP同IP-L的互作与黄化症状表达存在怎样的相关性?基于这一问题,我们首先要从ToMV CP同IP-L的互作机理问题入手,以两个蛋白间的互作为切入点,从根本上深入研究ToMV CP同IP-L的互作意义。为了进一步了解ToMV与寄主的互作机制,本文对ToMV CP与烟草IP-L的互作进行了初步分析。对IP-L的研究至今为止都只局限在烟草植株的叶片内,对于烟草植株其它部位IP-L的存在性一直未见提及。此外,对于其他茄科植物而言,这种与烟草花叶病毒CP存在互作的寄主因子是否也存在?针对烟草内IP-L的分布以及IP-L在茄科其他植物中的存在情况,我们提取烟草根、茎、叶及其他植物叶片的总RNA,用RT-PCR方法进行了检测和克隆分析。结果显示,IP-L并不是特异性地只在叶部存在,在茎中甚至根部都有存在同源基因。对辣椒、茄子、番茄、马铃薯中的IP-L同源基因克隆分析显示IP-L在这几种植物中同样存在。氨基酸序列分析显示,他们的IP-L氨基酸序列与烟草的IP-L氨基酸序列差异不大,与普通烟的氨基酸同源性分别是94.2%、94.7%、95.3%、94.9%,同时发现上述植物中的IP-L在与ToMV CP互作的必须区域--α螺旋区未见存在差别。张朝政等人的研究确定了IP-L与ToMV CP的体外结合位点,但是,这些位点是否也是在烟草植物体中二者发生互作的必需位点尚且不明确。因此,我将通过对IP-L基因与CP基因的突变或缺失,利用双分子荧光互补技术对存在相互作用的IP-L与ToMV CP进行进一步的证实,研究两个蛋白间相互作用的必需位点或片段以确定互作的关键部位。为了进一步确定ToMV CP与烟草IP-L在烟草体内的互作所需要的必需位点,我们对IP-L进行了两处突变(L9A及H12G),并且对CP进行两种缺失,缺失N端的106个氨基酸的CP缺失体以及缺失C端的105个氨基酸的CP缺失体。分别以IP-L突变体与缺失N端的106个氨基酸的CP缺失体及IP-L突变体与缺失C端的105个氨基酸的CP缺失体为两个目标蛋白,构建植物表达载体pUC-SPYCE-35S-△IP-L、pSPYNE-35S-△CP106和pSPYNE-35S-△CP105,利用双分子荧光互补技术分析了其互作情况。结果表明,△IP-L突变体(L9A,H2G)虽然使IP-L同ToMV CP的结合能力变弱,但不能使这种结合能力丧失。TOMV CP的缺失体△CP106和△CP105均能在烟草体内与IP-L互作。说明CP的C端54个氨基酸以及N端的55个氨基酸是实现其与IP-L互作的关键区。

全文目录

目录  5-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章文献综述  11-21
  1 番茄花叶病毒结构概况  11
  2 植物病毒编码的蛋白与寄主相关因子的互作研究进展  11-14
    2.1 运动蛋白与寄主因子的互作  12
    2.2 外壳蛋白与寄主因子的互作  12-13
    2.3 烟草花叶病毒外壳蛋白与烟草内蛋白IP-L互作  13-14
  3 研究蛋白互作的方法  14-18
    3.1 双分子荧光互补技术其在植物病毒与寄主互作研究的应用  14-17
    3.2 其他研究蛋白质互作的方法  17-18
  4 用于蛋白质结构功能研究的重叠延伸PCR  18-19
  5 研究的目的及意义  19-21
第二章 IP-L在烟草各部位和茄科植物中的分析  21-31
  1 材料和方法  21-25
    1.1 材料  21-22
    1.2 方法  22-25
  2 结果分析  25-29
    2.1 烟草内IP-L基因的分布检测  25-26
    2.2 部分茄科植物中IP-L基因的克隆分析  26-29
  3 讨论  29-31
第三章 ToMV CP蛋白与烟草IP-L蛋白在烟草体内的互作分析  31-57
  1 材料和方法  32-40
    1.1 材料  32
    1.2 方法  32-40
      1.2.1 BiFc载体的构建  32-38
      1.2.2 农杆菌感受态细胞制备  38
      1.2.3 农杆菌电击转化  38
      1.2.4 农杆菌渗透注射及在烟草内瞬时表达外源基因  38-39
      1.2.5 激光共聚焦扫描观察  39-40
  2 结果与分析  40-55
    2.1 BiFc表达载体的构建  40-50
    2.2 重组质粒转化入农杆菌  50
    2.3 农杆菌渗透注射烟草  50-51
    2.4 烟草IP-L和ToMV CP在烟草体内的互作分析  51-55
  3 结论与讨论  55-57
第四章总结与展望  57-59
  1 结论  57
    1.1 烟草各部位IP-L基因的分布  57
    1.2 茄科植物中IP-L基因的克隆分析  57
    1.3 IP-L中与ToMV CP互作的关键位点共定位分析  57
    1.4 ToMV CP中与IP-L互作的关键区域  57
  2 本研究的创新点  57
  3 有待进一步研究的问题  57-59
参考文献  59-67
附录A 本论文所用缩写词及中英文对照  67-69
附录B 常用生化及分子生物学试剂与仪器  69-71
附录C 常用试剂的配制  71-73
致谢  73-75
在学期间发表和已录用论文及参加课题  75

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害 > 病毒
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