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一种复合花肽的制备方法及其在制备化妆品中的应用与流程

来源：花匠小妙招时间：2026-01-08 04:41

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1.本发明涉及植物来源活性花肽的制备及在化妆品中的应用领域，特别涉及一种复合花肽的制备方法及其在制备化妆品中的应用。

背景技术：

2.蛋白质是植物重要的一类成份，将植物中蛋白质通过一定工艺，制备得到的肽，在抗氧化化、抗菌等方面的活性已经被证明且有越来越广泛的应用。植物来源的活性肽，相对合成肽，在安全性、毒性等方面有一定优势。
3.花是植物重要的组成部分，所含的蛋白质对花以及整个植物的生长都有重要作用，花提取物在护肤品中的应用已经非常广泛，但从花中提取肽类成份用于化妆品中，还较为鲜见。

技术实现要素：

4.本方案的一个目的在于提供一种复合花肽的制备方法，通过酶解-发酵联用技术获得含有多种花肽的复合花肽，含有该复合花肽的护肤品具有良好的抗衰老功效。
5.为达到上述目的，本方案如下：
6.一种复合花肽的制备方法，该方法包括如下步骤：
7.以多种花为原料，采用碱溶酸沉法分别制备每种原料花蛋白；
8.在与每种原料花相应的蛋白酶的作用下，获得每种原料花蛋白的酶解液；
9.将每种原料花蛋白的酶解液经双歧杆菌发酵，得不同原料花蛋白的酶解发酵液；将所述酶解发酵液过滤，干燥，获得每种原料花的花肽；
10.将多种原料花的花肽混合获得复合花肽。
11.优选的，该方法还包括通过预处理将每种原料花粉碎，预处理包括热处理，超声处理或高压处理。
12.优选的，所述碱溶酸沉法包括：
13.将经预处理获得的每种原料花粉与水混合，按料液质量比1:20～1:30混合；
14.将混合料液打成均匀的浆状；
15.向混合料液中加入碳酸钠溶液，静置，离心，过滤，调节滤液ph值；
16.向滤液中加入冰乙酸或盐酸，调节溶液ph值为4～5，在5℃条件下静置12～17h，离心去除上清液得沉淀，沉淀为该种原料花蛋白。
17.优选的，所述原料花为百合花时，加入的碳酸钠溶液与原料花粉的质量比为1:1～2:1，碳酸钠溶液的浓度为0.5mol/l；静置时间为1.5～2.5h，离心转速为5000r/min，离心时间为20min，离心过滤后调节滤液ph值为9～10；
18.所述原料花为牡丹花时，加入的碳酸钠溶液与原料花粉的质量比为2:1～3:1，静置时间为1.5～2.5h，离心转速为5000r/min，离心时间为20min，离心过滤后调节滤液ph值为6～7。
19.优选的，所述在不同蛋白酶的作用下获得不同原料花蛋白的酶解液包括：
20.将每种原料花蛋白与适用于该种花的蛋白酶及水加入反应容器中，使反应物充分分散，调节溶液ph值，水浴加热；离心，取上清液，得该种原料花蛋白的酶解液。
21.优选的，所述原料花为百合花时，所述蛋白酶为alcalase碱性蛋白酶，酶活》600000u/g，酶底比》5000u/g；
22.所述原料花为牡丹花时，所述蛋白酶为neutrase中性蛋白酶，酶活》300000u/g，酶底比》5000u/g。
23.优选的，当原料花为百合花时，水浴加热前调节溶液的ph值为8～8.5；当原料花为牡丹花时，水浴加热前调节溶液的ph值为6～7；
24.水浴加热包括在不同温度下的两个连续加热阶段，其中，第一阶段水浴加热的温度为50～55℃，加热时间为3～4h；第二阶段水浴加热的温度为90～95℃，加热时间为15～20min。
25.优选的，将每种原料化蛋白的酶解液经双歧杆菌发酵，得不同原料花蛋白的酶解发酵液，将所述酶解发酵液过滤，干燥，获得每种原料花的花肽包括：
26.常温下，对酶解发酵液进行离心过滤，得到的滤液再经超滤分级得过滤物，经分子量测试，选取过滤物组分中有80％以上的组分的相对分子质量在200da以下的过滤物进行冷冻干燥，得到原料花花肽。
27.优选的，所述将多种原料花的花肽混合获得复合花肽包括，将第一种原料花花肽与第二种原料花花肽按质量比1:1～10:1的比例混合，获得复合花肽。
28.第二方面，根据上述任一项所述的制备方法制备的复合花肽，在制备化妆品中的应用。
29.本方案的有益效果如下：
30.本方法利用酶解-发酵联用技术，定向提取活性肽，产物主要成份明确，大大降低了安全风险，生物活性显著，充分利用了牡丹花和百合花资源，提高了产物的性价比；且通过筛选不同预处理方式，提高了碱提酸沉工艺蛋白得率，有利于资源的充分利用；筛选不同蛋白酶，得到分子量更低、抗氧化能力更强的产物，提升了产物的性价比；对比筛选干燥工艺，利于提升产物抗氧化、抗衰老功效。
附图说明
31.为了更清楚地说明本方案的实施，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本方案的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为各实施例粗蛋白含量示意图；
33.图2为各实施例抗氧化能力orac值示意图；
34.图3为各实施例β～半乳糖苷酶活性抑制率示意图；
35.图4a为百合花肽与牡丹花肽复配协同增效示意图一；
36.图4b为百合花肽与牡丹花肽复配协同增效示意图二；
37.图5为酶解法花肽鸡胚绒毛尿囊膜血管实验；
38.图6为酶解-发酵法花肽鸡胚绒毛尿囊膜血管实验。
具体实施方式
39.下面将结合附图对本方案的实施方式作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅是本方案的一部分实施例，而不是所有实施例的穷举。需要说明的是，在不冲突的情况下，本方案中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
40.说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的实施例能够以除了在这里图示或描述的内容以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备，不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
41.应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
42.植物来源活性肽制备有多种途径，水解法、酶解法等，酶解法制备活性肽具有环保、成本低、活性高的优点。而酶解法中，预处理方式、蛋白酶种类、料液比、浸提温度、分离方式等工艺环节，对产物的分子量及活性均有一定程度影响。经发明人研究发现如果使用酶解法，需要先将目标植物中的蛋白质提取出来，而目前常用的酶解法获得的产物存在一定的安全风险，且分子量分布中大分子量的占比较高。因此，本技术的发明人提供了一种复合花肽的制备方法，该方法包括如下步骤：
43.1.预处理
44.分别将牡丹花、百合花粉碎，采用微波对牡丹花及百合花进行预处理，微波功率300w,微波时间3～7分钟。预处理工艺不限于微波处理，包含热处理、超声处理、高压处理等。
45.2.蛋白制备
46.采用碱溶酸沉法制备牡丹花蛋白及百合花蛋白。
47.组分1：百合花肽蛋白
48.碱溶：将预处理后的百合花粉末(花粉质量为m1)，按料液比1：20至1：30，加入水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液(碳酸钠溶液质量为m)(m:m1＝1:1～2:1),静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，滤液ph值为9～10；
49.酸沉：向滤液中加入冰乙酸或盐酸等，调至ph值为4.6，在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀，即为百合花肽。
50.组分2：牡丹花蛋白
51.碱溶：将预处理后的牡丹花粉末(花粉质量为m2),按料液比1：26，加入水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液(碳酸钠溶液质量为m)(m:m2＝2:1～3:1)，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，滤液ph值为6～7；
52.酸沉：向滤液中加入冰乙酸或盐酸等，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，
离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，去除上清液，得沉淀，即为牡丹花蛋白。
53.3.酶解
54.组分3：百合花酶解液
55.将水，占酶解液总质量5％的百合花蛋白(组分1)，及alcalase碱性蛋白酶(酶活》60万u/g，酶底比》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度55℃，时间3～4小时，用90～95℃的水浴15～20min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到百合花酶解液；本步骤中，选用酶不限于alcalase碱性蛋白酶，可包括动物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶等，相关工艺参数ph值、温度及反应时间，依据酶种类做相应调整。
56.组分4：牡丹花酶解液
57.将水，占酶解液总质量5％的牡丹花蛋白(组分2)，及neutrase中性蛋白酶(酶活》30万u/g，酶底》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至6～7，水浴加热，温度50℃，时间3～4小时，用90～95℃的水浴15～20min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到牡丹花酶解液。
58.本步骤中，选用酶不限于alcalase碱性蛋白酶，可包括动物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶等，相关工艺参数ph值、温度及反应时间，依据酶种类做相应调整；
59.4.发酵
60.组分5：百合花酶解发酵液
61.(1)配置发酵培养基
62.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、0.1-0.5％柠檬酸、89.7～97.8％的百合花酶解液混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
63.(2)百合花酶解发酵液制备
64.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1～3:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h；
65.组分6：牡丹花酶解发酵液
66.(1)配置发酵培养基
67.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、89.7～97.8％的牡丹花酶解液，混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
68.(2)牡丹花酶解发酵液制备
69.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1～3:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h；
70.经过筛选，每种原料花使用与该种花相应的蛋白酶经碱溶酸沉酶解后，进行益生菌发酵，可以提升安全性，使得产物能够在化妆品中应用；
71.5.分离
72.组分7：百合花肽
73.将组分5离心，转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，将滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行冷冻干燥，得到百合花肽。本步骤中，干燥方式还可含喷雾干燥、热风干燥等；
74.组分8：牡丹花肽
75.将组分6离心，转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，将滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行冷冻干燥，得到百合花肽。本步骤中，干燥方式还可包含喷雾干燥、热风干燥等；
76.6.复合花肽制备
77.将组分7与组分8按1:1至10:1的质量比进行混合，测试dpph自由基清除率、抗衰老功效评价，选取功效评价效果好的组合物，即为复合花肽。
78.将制备出的复合花肽用于化妆品中，具有明显的抗衰老功效。
79.下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。
80.实施例1
81.1.分别将牡丹花、百合花粉碎，采用微波对牡丹花及百合花进行预处理，微波功率300w，微波时间5分钟；
82.2.将预处理后的百合花粉末120g，加入2500g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状，加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液225g，调节料液ph值为10.2～10.3，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为9.56；向滤液中加入盐酸，调至ph值为4.6，在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀125克，即为百合花肽，测百合花蛋白含量；
83.将预处理后的牡丹花粉末120g，加入3000g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液350g，调节料液ph值为10～10.2，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为6～7；
84.向滤液中加入盐酸等，调至ph值为4.6，在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀660克，即为牡丹花蛋白，测百合花蛋白含量；
85.3.将水，占酶解液总质量5％的百合花蛋白，及alcalase碱性蛋白酶(酶活》60万u/g，酶底比》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度55℃，时间3小时，用95℃的水浴15min，进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到百合花酶解液；
86.将水，占酶解液总质量5％的牡丹花蛋白，及neutrase中性蛋白酶(酶活》30万u/g，酶底》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度37℃，时间4小时，用95℃的水浴15min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到牡丹花酶解液；
87.4.制备百合花酶解发酵液
88.(1)配置发酵培养基
89.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1
～0.3％吐温-80、0.1-0.5％柠檬酸、89.7～97.8％的百合花酶解液混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
90.(2)百合花酶解发酵液制备
91.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得百合花酶解发酵液；
92.5.获得百合花肽
93.将百合花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到百合花肽；
94.6.制备牡丹花酶解发酵液
95.(1)配置发酵培养基
96.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、89.7～97.8％的牡丹花酶解液，混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
97.(2)牡丹花酶解发酵液制备
98.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得牡丹花酶解发酵液；
99.7.获得牡丹花肽
100.将牡丹花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到牡丹花肽；
101.8.将百合花肽与牡丹花肽按10：1的质量比进行混合，测试dpph自由基清除率、抗衰老功效评价，得到复合花肽。
102.实施例2
103.1.分别将牡丹花、百合花粉碎，采用微波对牡丹花及百合花进行预处理，微波功率300w，微波时间5分钟；
104.2.将预处理后的百合花粉末120g，加入2500g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液225g，调节料液ph值为10.2～10.3，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为9.56；
105.向滤液中加入冰乙酸，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀125克，即为百合花肽，测百合花蛋白含量。
106.将预处理后的牡丹花粉末120g，加入3000g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液350g，调节料液ph值为10～10.2，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为6～7；
107.向滤液中加入冰乙酸等，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离
心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀660克，即为牡丹花蛋白，测百合花蛋白含量；
108.3.将水，占酶解液总质量5％的百合花蛋白，及alcalase碱性蛋白酶(酶活》60万u/g，酶底比》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度55℃，时间3小时，用95℃的水浴15min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到百合花酶解液。
109.将水，占酶解液总质量5％的牡丹花蛋白，及neutrase中性蛋白酶(酶活》30万u/g，酶底》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度37℃，时间4小时，用95℃的水浴15min，进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到牡丹花酶解液；
110.4.制备百合花酶解发酵液
111.(1)配置发酵培养基
112.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、0.1-0.5％柠檬酸、89.7～97.8％的百合花酶解液混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
113.(2)百合花酶解发酵液制备
114.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得百合花酶解发酵液；
115.5.获得百合花肽
116.将百合花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到百合花肽；
117.6.制备牡丹花酶解发酵液
118.(1)配置发酵培养基
119.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、89.7～97.8％的牡丹花酶解液，混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
120.(2)牡丹花酶解发酵液制备
121.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得牡丹花酶解发酵液；
122.7.获得牡丹花肽
123.将牡丹花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到牡丹花肽；
124.8.将百合花肽与牡丹花肽按10：1的质量比进行混合，测试dpph自由基清除率、抗衰老功效评价，得到复合花肽。
125.实施例3
126.1.分别将牡丹花、百合花粉碎，采用高压法及热处理法对牡丹花及百合花进行预处理，压力50kpa，温度110℃，时间5分钟；
127.2.将预处理后的百合花粉末120g，加入2500g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液225g，调节料液ph值为10.2～10.3，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为9.56；
128.向滤液中加入冰乙酸，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀125克，即为百合花肽，测百合花蛋白含量；
129.将预处理后的牡丹花粉末120g，加入3000g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液350g，调节料液ph值为10～10.2，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，调节离心20min，滤液ph值为6～7；
130.向滤液中加入冰乙酸等，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀660克，即为牡丹花蛋白，测百合花蛋白含量；
131.3.将水，占酶解液总质量5％的百合花蛋白，及alcalase碱性蛋白酶(酶活》60万u/g，酶底比》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度55℃，时间3小时，用95℃的水浴15min，进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到百合花酶解液；
132.将水，占酶解液总质量5％的牡丹花蛋白，及neutrase中性蛋白酶(酶活》30万u/g，酶底》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度37℃，时间4小时，用95℃的水浴15min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到牡丹花酶解液；
133.4.制备百合花酶解发酵液
134.(1)配置发酵培养基
135.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、0.1-0.5％柠檬酸、89.7～97.8％的百合花酶解液混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
136.(2)百合花酶解发酵液制备
137.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得百合花酶解发酵液；
138.5.获得百合花肽
139.将百合花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到百合花肽；
140.6.制备牡丹花酶解发酵液
141.(1)配置发酵培养基
142.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1
～0.3％吐温-80、89.7～97.8％的牡丹花酶解液，混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
143.(2)牡丹花酶解发酵液制备
144.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得牡丹花酶解发酵液；
145.7.获得牡丹花肽
146.将牡丹花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到牡丹花肽；
147.8.将百合花肽与牡丹花肽按10：1的质量比进行混合，测试dpph自由基清除率、抗衰老功效评价，得到复合花肽。
148.实施例4
149.1.分别将牡丹花、百合花粉碎，采用微波对牡丹花及百合花进行预处理，微波功率300w，微波时间5分钟；
150.2.将预处理后的百合花粉末120g，加入2500g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液225g，调节料液ph值为10.2～10.3，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为9.56；
151.向滤液中加入冰乙酸，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀125克，即为百合花肽，测百合花蛋白含量；
152.将预处理后的牡丹花粉末120g，加入3000g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液350g，调节料液ph值为10～10.2，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为6～7；
153.向滤液中加入冰乙酸等，调至ph值为4.6，在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀660克，即为牡丹花蛋白，测百合花蛋白含量；
154.3.将水，占酶解液总质量5％的百合花蛋白，及alcalase碱性蛋白酶(酶活》60万u/g，酶底比》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度55℃，时间3小时，用95℃的水浴15min，进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到百合花酶解液；
155.将水，占酶解液总质量5％的牡丹花蛋白，及neutrase中性蛋白酶(酶活》30万u/g，酶底》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至6～7，水浴加热，温度50℃，时间3小时，用95℃的水浴15min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到牡丹花酶解液；
156.4.制备百合花酶解发酵液
157.(1)配置发酵培养基
158.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1
～0.3％吐温-80、0.1-0.5％柠檬酸、89.7～97.8％的百合花酶解液混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
159.(2)百合花酶解发酵液制备
160.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得百合花酶解发酵液；
161.5.获得百合花肽
162.将百合花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到百合花肽；
163.6.制备牡丹花酶解发酵液
164.(1)配置发酵培养基
165.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、89.7～97.8％的牡丹花酶解液，混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
166.(2)牡丹花酶解发酵液制备
167.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得牡丹花酶解发酵液；
168.7.获得牡丹花肽
169.将牡丹花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到牡丹花肽；
170.8.将百合花肽与牡丹花肽按10：1的质量比进行混合，测试dpph自由基清除率、抗衰老功效评价，得到复合花肽。
171.实施例5
172.1.分别将牡丹花、百合花粉碎，采用微波对牡丹花及百合花进行预处理，微波功率300w，微波时间5分钟；
173.2.将预处理后的百合花粉末120g，加入2500g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液225g，调节料液ph值为10.2～10.3，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为9.56；
174.向滤液中加入冰乙酸，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀125克，即为百合花肽，测百合花蛋白含量；
175.将预处理后的牡丹花粉末120g，加入3000g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液350g，调节料液ph值为10～10.2，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为6～7；
176.向滤液中加入冰乙酸等，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离
心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀660克，即为牡丹花蛋白，测百合花蛋白含量；
177.3.将水，占酶解液总质量5％的百合花蛋白，及alcalase碱性蛋白酶(酶活》60万u/g，酶底比》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度55℃，时间3小时，用95℃的水浴15min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到百合花酶解液；
178.将水，占酶解液总质量5％的牡丹花蛋白，及neutrase中性蛋白酶(酶活》30万u/g，酶底》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至6～7，水浴加热，温度50℃，时间3小时，用95℃的水浴15min,进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到牡丹花酶解液；
179.4.制备百合花酶解发酵液
180.(1)配置发酵培养基
181.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、0.1-0.5％柠檬酸、89.7～97.8％的百合花酶解液混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
182.(2)百合花酶解发酵液制备
183.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得百合花酶解发酵液；
184.5.获得百合花肽
185.将百合花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到百合花肽；
186.6.制备牡丹花酶解发酵液
187.(1)配置发酵培养基
188.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、89.7～97.8％的牡丹花酶解液，混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
189.(2)牡丹花酶解发酵液制备
190.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得牡丹花酶解发酵液；
191.7.获得牡丹花肽
192.将牡丹花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到牡丹花肽；
193.8.将百合花肽与牡丹花肽按10：1的质量比进行混合，测试dpph自由基清除率、抗衰老功效评价，得到复合花肽。
194.实施例6
195.1.分别将牡丹花、百合花粉碎，采用微波对牡丹花及百合花进行预处理，微波功率300w，微波时间5分钟；
196.2.将预处理后的百合花粉末120g，加入2500g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液225g，调节料液ph值为10.2～10.3，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为9.56；
197.向滤液中加入冰乙酸，调至ph值为4.6,在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀125克，即为百合花肽，测百合花蛋白含量；
198.将预处理后的牡丹花粉末120,加入3000g水中，使用破壁机将料液打成均匀的浆状。加入浓度为0.5mol/l的碳酸钠溶液350g，调节料液ph值为10～10.2，静置2小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min，调节滤液ph值为6～7；
199.向滤液中加入冰乙酸等，调至ph值为4.6，在5℃冰箱中静置15小时，离心过滤，离心速率为5000r/min，离心20min去除上清液，得沉淀660克，即为牡丹花蛋白，测百合花蛋白含量；
200.3.将水，占酶解液总质量5％的百合花蛋白，及alcalase碱性蛋白酶(酶活》60万u/g，酶底比》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至8～8.5，水浴加热，温度55℃，时间3小时，用95℃的水浴15min，进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到百合花酶解液；
201.将水，占酶解液总质量5％的牡丹花蛋白，及neutrase中性蛋白酶(酶活》30万u/g，酶底》5000u/g)等所有物料加入反应容器中，使用水浴振荡器使物料充分分散，调ph值至6～7，水浴加热，温度50℃，时间3小时，用95℃的水浴15min，进行蛋白酶灭活，0～5℃冰箱冷藏过夜，离心除杂，取上清液，得到牡丹花酶解液；
202.4.制备百合花酶解发酵液
203.(1)配置发酵培养基
204.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～0.3％吐温-80、0.1-0.5％柠檬酸、89.7～97.8％的百合花酶解液混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
205.(2)百合花酶解发酵液制备
206.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得百合花酶解发酵液；
207.5.获得百合花肽
208.将百合花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到百合花肽；
209.6.制备牡丹花酶解发酵液
210.(1)配置发酵培养基
211.按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1
～0.3％吐温-80、89.7～97.8％的牡丹花酶解液，混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；
212.(2)牡丹花酶解发酵液制备
213.将双歧杆菌接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为1:50；厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，即得牡丹花酶解发酵液；
214.7.获得牡丹花肽
215.将牡丹花酶解发酵液进行离心操作，离心转速为2500～3500rmp/min，离心时间20～30min，过300目筛过滤，得到滤液，对滤液进行超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到牡丹花肽；
216.8.将百合花肽与牡丹花肽按10：1的质量比进行混合，测试dpph自由基清除率、抗衰老功效评价，得到复合花肽。
217.对上述各实施例制备的复合花肽进行检测，检测方法及结果如下：
218.检测评价方法：
219.1.粗蛋白质含量测试
220.样品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量。
221.2.抗氧化能力指数orac值评价
222.精确吸取1g样品于15ml离心管中，用10ml超纯水稀释，得到100mg/ml的样品溶液，通过预实验摸索dpph评价适宜浓度，最终得到该样品的浓度系列：
223.基于orac反应在75mmol磷酸钾缓冲液(ph＝7.4)环境中进行,在37℃下预置5min后,用多道移液器迅速在各孔中加入aaph 140μl启动反应,并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波长485nm,发射波长538nm进行连续测定,每2min测定一次各孔荧光强度,测定时间一般设定在荧光衰减呈基线后为止。
224.3.安全性评价
225.依据：《化妆品安全技术规范》(2015版)，以临床医学为理论基础，由特定实验人群组成受试群体，在受试者指定部位进行斑贴试验，从而确定化妆品对人体皮肤存在不良反应的潜在可能性。选用合格斑试材料。将受试物放入斑试器内，用量约为0.020g～0.025g(固体或半固体)或0.020ml～0.025ml(液体，可滴加在斑试器所附的滤纸片上置于斑试器内)。
226.受试物为化妆品终产品原物时，对照孔为空白对照(不置任何物质)，受试物为稀释后的化妆品时，对照孔内使用该化妆品的稀释剂。
227.将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的背部或前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。
228.去除受试物斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应。如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。按表1(皮肤不良反应分级标准表)记录反应结果。
229.表1
[0230][0231]
皮肤封闭型斑贴试验结果如出现下述情况，则判定受试物对人体有不良反应，如30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或2级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例3级或3级以上皮肤不良反应时。
[0232]
将制备出的复合花肽用于护肤品，并对其抗衰老功效进行检测。
[0233]
抗衰老功效评价
[0234]
研究表明，衰老细胞有着显著的特性，衰老细胞细胞通常体积变大，衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)在ph 6.0环境中活性上调，因此，通过β-半乳糖苷酶活性抑制实验评价活性物抗衰老已经被认可和广泛应用，实施例1至6的抗衰老功效评价检测结果如表2所示。
[0235]
表2
[0236][0237][0238]
从表2的不同实施例的复合花肽检测评价分析可得出，预处理方式微波法优于高压法，酸沉工艺中，冰乙酸较盐酸有更好的安全性。如图1所示，使用胰蛋白酶的产物分子量更小，粗蛋白含量略高于其他蛋白酶。如图3所示，百合花肽与牡丹花肽1:1复配比例，β-半乳糖苷酶活性抑制率较1:10复配比例高，但花源肽(1:1)抗氧化能力指数orac值略低，如图2所示。冷冻干燥对产物的抗氧化能力及抗衰老活性保持方面优于喷雾干燥，但会大幅增加成本。百合花肽与牡丹花肽复配后，抗氧化能力指数orac值及抗衰老评价的β-半乳糖苷酶活性抑制率都有了协同增效，综合功效提升，如图4a和图4b所示。
[0239]
通过上述检测可知，实施例4、5和6的抗衰老效果较好。
[0240]
通过上述实施例，可知通过筛选不同预处理方式，提高了碱提酸沉工艺蛋白得率，有利于资源的充分利用；筛选不同蛋白酶，得到分子量更低、抗氧化能力更强的产物，提升了产物的性价比；对比筛选干燥工艺，利于提升产物抗氧化、抗衰老功效。
[0241]
对比例1：本对比例旨在研究发酵工艺对酶解液的影响，酶解工艺按实施例4中步骤1-3分别制备百合花酶解液与牡丹花酶解液，之后对酶解液超滤分级，操作压力0.35mpa，温度常温，测试分子量，选取相对分子质量200da以下占80％以上的超滤组分，进行喷雾干燥，得到百合花肽与牡丹花肽。百合花肽与牡丹花肽按10：1质量比进行混合，得到复合花肽。
[0242]
将对比例1与实施例4制备得到的复合花肽，分别进行鸡胚绒毛尿囊膜血管实验，实验结果证明酶解液会引起鸡胚绒毛尿囊膜血管溶血形成血斑如图5所示，发酵后未出现溶血现象，如图6所示，说明发酵工艺降低了复合花肽的安全风险。
[0243]
本技术与牡丹花、百合花现有提取技术相比，利用酶解技术，定向提取活性肽，产物主要成份明确，安全性好，生物活性显著，充分利用了牡丹花和百合花资源，提高了产物的性价比。
[0244]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。