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一种蒙自兰快速繁殖方法及培养基与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-05-23 17:42

一种蒙自兰快速繁殖方法及培养基与流程

1.本发明涉及兰科植物快速繁殖领域，尤其涉及一种蒙自兰快速繁殖方法及培养基。

背景技术：

2.蒙自兰mengzia foliosa(king&pantl.)w.c.huang,z.j.liu&c.hu，兰科多年生草本植物，分布于中国云南南部、泰国的山坡林下。(备注：原名华白及，针对华白及所在的兰科龙嘴兰族系统发育的研究结果表明，华白及不属于白及属物种，应该单独成立新属-蒙自兰属。国际植物学期刊molecular phylogenetics and evolution上在线发表该研究成果，华白及更名为蒙自兰)。
3.蒙自兰(原名华白及)的野生资源稀少，已被列入国家珍稀濒危保护的濒危植物(endangered,en)(中国高等植物受威胁物种名录)和《华盛顿公约》(cites)——附录ⅱ。其模式标本由英国植物采集家奥古斯汀
·
亨利于1898年采自云南蒙自，存放于英国伦敦邱园标本馆。发现至今120年左右，鲜有发现野生种群的报道，研究者对它的了解局限于馆藏的3份标本。上海辰山植物园研究人员于2018年5月在其模式产地云南蒙自发现疑似野生种群，移种上海辰山植物园后开花鉴定确认；随后开展了一系列人工栽培和繁殖研究实验。最近有报道远离模式产地的云南省镇康县发现了另一个野外居群，其种群数量不超过300株。
4.兰科植物种子细小，且胚发育不完全。自然状态下种子萌发率很低，且须借助共生菌提供营养。人工栽培条件下不同兰花种子需要的无菌培养基各异。种苗快繁是实现野生濒危兰科植物资源再生和合理开发利用的有效途径。而传统的繁殖方式为假鳞茎分株繁殖，该方法操作简单，但繁殖系数低，繁殖周期长，难以满足大规模的种苗需求。为加快繁殖速度，缩短繁殖周期，在规模化的育苗中通常采用无菌培养的方式。而蒙自兰由于野外材料资源稀缺，其无菌播种及快速繁殖相关研究空白。假如能够建立一套高效的快速繁殖技术体系，不但可以为该物种的种群回归和恢复等保育生物学研究提供帮助，还能为其开花调控机理研究和缩短育种周期提供理论依据，以及为进一步开发蒙自兰植物资源奠定基础。因此，如何实现蒙自兰快速繁殖，帮助该物种的大规模人工繁育是本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

5.本发明提供一种蒙自兰快速繁殖方法，包括以下步骤：
6.s1准备材料：选取健康的蒙自兰植株，于开花时进行人工授粉，将授粉后的形成的蒴果的种子用作播种；
7.s2无菌播种：将种子接种到萌发培养基上待其萌发，所述萌发培养基包含ms基础培养基、1/2ms基础培养基、1/3ms基础培养基中的一种；
8.s3丛芽增殖：将萌发后叶片分化的小苗接种到增殖培养基上待其增殖，所述增殖培养基包含1/2ms基础培养基；
9.s4生根壮苗：将增殖后的小苗接种到壮苗培养基上待其生根壮苗，所述壮苗培养
基包含1/2ms基础培养基；
10.s5移栽：将生根壮苗后的蒙自兰瓶苗转移到温室内，5—7天后将无菌苗从培养瓶中取出、冲洗、种植在介质中，再置于温室内遮阴处，室温不超过28℃，保持湿度60％—70％，待植株稳定生长后进行水肥养护。
11.在一种可行的方案中，上述步骤s1、s2阶段，所述用于萌发的种子的成熟度为85—115天，其中人工花授粉后105天形成的蒙自兰种子活力较强，同等条件下萌发率最高。
12.在一种可行的方案中，上述步骤s2中，所述ms基础培养基每升含30g蔗糖、6.5g琼脂、0.2g活性炭、硝酸钾190mg硝酸钾、165mg硝酸铵、18mg硫酸镁、17mg磷酸二氢钾、33mg氯化钙、0.86mg七水硫酸锌、0.62mg硼酸、2.82mg四水硫酸锰、0.0025mg五水硫酸铜、0.0212mg钼酸钠、0.0014mg氯化钴、0.083mg碘化钾、3.73mg乙二胺四乙酸二钠、2.78mg七水硫酸亚铁、0.2mg甘氨酸、0.05mg烟酸、0.01mg盐酸硫胺素、0.05mg盐酸吡哆醇、10mg肌醇，余量为蒸馏水，ph5.8。
13.在一种可行的方案中，上述步骤s2中，所述1/2ms基础培养基每升含30g蔗糖、6.5g琼脂、0.2g活性炭、硝酸钾95mg硝酸钾、82.5mg硝酸铵、9mg硫酸镁、8.5mg磷酸二氢钾、16.5mg氯化钙、0.43mg七水硫酸锌、0.31mg硼酸、1.41mg四水硫酸锰、0.00125mg五水硫酸铜、0.0106mg钼酸钠、0.0007mg氯化钴、0.0415mg碘化钾、1.865mg乙二胺四乙酸二钠盐二水、1.39mg七水硫酸亚铁、0.1mg甘氨酸、0.025mg烟酸、0.005mg盐酸硫胺素、0.025mg盐酸吡哆醇、5mg肌醇，余量为蒸馏水，ph5.8。
14.在一种可行的方案中，上述步骤s2中，所述1/3ms基础培养基每升含30g蔗糖、6.5g琼脂、0.2g活性炭、硝酸钾63.3mg硝酸钾、55mg硝酸铵、6mg硫酸镁、5.7mg磷酸二氢钾、11mg氯化钙、0.29mg七水硫酸锌、0.33mg硼酸、0.94mg四水硫酸锰、0.0008mg五水硫酸铜、0.0071mg钼酸钠、0.0005mg氯化钴、0.0277mg碘化钾、1.24mg乙二胺四乙酸二钠、0.93mg七水硫酸亚铁、0.07mg甘氨酸、0.017mg烟酸、0.003mg盐酸硫胺素、0.017mg盐酸吡哆醇、3.33mg肌醇，余量为蒸馏水，ph5.8。
15.在一种可行的方案中，上述步骤s2中，具体包括以下无菌处理步骤：将蒙自兰蒴果在水流下冲洗20min，在超净工作台用75％酒精浸泡30s后，用含少许吐温20的0.1％升汞溶液震荡消毒12min，无菌水漂洗4次，滤纸吸干蒴果表面水分，然后切开蒴果，再将种子接种到播种培养基上待其萌发。
16.在一种可行的方案中，上述步骤s2—s4中，环境条件具体为：
17.温度:23—27℃，
18.光照强度：2000—2500lux，
19.光源：led灯白光，
20.光照时长：12小时/天，
21.湿度：50％—70％。
22.在一种可行的方案中，上述步骤s2—s4中，环境条件具体为：温度为24—26℃，光照强度为2000lx。
23.在一种可行的方案中，上述步骤s5中，环境条件具体为：
24.温度:22—28℃，
25.自然光照强度：3000—5000lux，
26.湿度：60％—70％。
27.在一种可行的方案中，上述步骤s5中，所述介质中的树皮:草炭:兰石的质量比为1:2:1。
28.在研究蒙自兰种子萌发培养基、丛芽增殖、生根壮苗等植株生长阶段，使用基础培养基的是兰科常用的ms、kc、花宝等基础培养基，通过实验发现培养基种类对蒙自兰的种子萌发和生长影响不显著，而培养基的浓度对蒙自兰种子萌发和生长影响较显著，1/2ms浓度的基础培养基作为蒙自兰的基础培养基对种子萌发和生长效果更好。一些植物激素、植物匀浆(例如香蕉匀浆、土豆匀浆、椰青等)的添加，对蒙自兰种子萌发和生长影响则非常显著。例如，在蒙自兰种子萌发培养基中添加，每升0—1mgnaa(萘乙酸)、0—1.5mg6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)，能更极大提高蒙自兰种子的萌发率，其中采用1/2ms基础培养基+每升0.6mg naa+每升1mg6-ba促进种子萌发率最佳；在蒙自兰丛芽增殖培养基中添加，每升0—0.5mgnaa、0.5—2.5mg6-ba，能够促进蒙自兰丛芽增殖速度，其中1/2ms基础培养基+每升1mg6-ba+每升0mgnaa配比效果最佳；在蒙自兰壮苗生根培养基中添加，每升0—1mgnaa、0—100g香蕉匀浆、0—100g土豆匀浆、0—100ml椰青，能够促进蒙自兰丛芽快速长成外观较好且适合移栽的蒙自兰小苗，其中1/2ms+每升1mgnaa+每升30g土豆匀浆的配比效果最佳。
29.对于快速培养的成熟蒙自兰植株，不同植物激素的配比对促进蒙自兰开花，以及对花的形状影响显著；因此在蒙自兰培养基中添加，每升0—2mg6-ba、0—0.5mgnaa、0—0.5mgtdz(噻苯隆)、0—0.5mg2,4-d(2，4-二氯苯氧乙酸)、0—1mgpp333(多效唑)、0—30g香蕉匀浆，能够促进快速繁殖形成的蒙自兰植株花芽形成以及提升所开花的正常开花率，其中1/2ms培养基+每升1mg 6-ba+每升0.5mgnaa+每升1mgpp
333
培养基，促进蒙自兰开花率最高，达84％。
30.基于上述方案可知，本发明将蒙自兰种子作为外植体，采用不同培养基经过控制蒙自兰种子的采摘时间，种子无菌处理和播种、丛芽增殖、壮苗培养和无菌苗移栽的繁殖步骤，可以获得大量幼苗。且该种方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好、成本低等特点；种子萌发率高达97％，幼苗移栽成活率最高在90％以上；通过催花培养基培养，快速繁殖的蒙自兰植株正常开花率大于84％。故，本发明提供的技术方案能为蒙自兰种苗生产提供一条有效途径。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施方案：
33.s1准备材料：选取健康的蒙自兰植株，于开花时进行人工授粉，将授粉后发育且未开裂的果实里的种子用作播种，其中授粉后的天数即为种子的成熟度。
34.s2无菌播种：将蒙自兰蒴果在水流下冲洗20min，在超净工作台用75％酒精浸泡30s后，用含少许吐温20的0.1％升汞溶液震荡消毒12min，无菌水漂洗4次，滤纸吸干蒴果表面水分。然后切开蒴果，将种子接种到配制好的萌发培养基上。
35.为了更好的展示效果效果，以下分a和b两个子方案进行实验：
36.a.播种不同成熟度种子,分别为85天、95天、105天、115天(成熟度为从自交到播种的天数)在1/2ms培养基上，另每升附加0.5mg萘乙酸(naa)，观察种子萌发差异，记录萌发时间并统计萌发率。其中，1/2ms基础培养基每升含30g蔗糖、6.5g琼脂、0.2g活性炭、硝酸钾95mg硝酸钾、82.5mg硝酸铵、9mg硫酸镁、8.5mg磷酸二氢钾、16.5mg氯化钙、0.43mg七水硫酸锌、0.31mg硼酸、1.41mg四水硫酸锰、0.00125mg五水硫酸铜、0.0106mg钼酸钠、0.0007mg氯化钴、0.0415mg碘化钾、1.865mg乙二胺四乙酸二钠盐二水、1.39mg七水硫酸亚铁、0.1mg甘氨酸、0.025mg烟酸、0.005mg盐酸硫胺素、0.025mg盐酸吡哆醇、5mg肌醇，余量为蒸馏水，ph5.8。
37.b.取最佳成熟度(105天)的种子，分别播种在不同培养基上，基础培养基为ms、1/2ms和1/3ms，另附加不同浓度生长调节剂0—1mg萘乙酸(naa)、0—1.5mg6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)。其中，ms基础培养基每升含30g蔗糖、6.5g琼脂、0.2g活性炭、硝酸钾190mg硝酸钾、165mg硝酸铵、18mg硫酸镁、17mg磷酸二氢钾、33mg氯化钙、0.86mg七水硫酸锌、0.62mg硼酸、2.82mg四水硫酸锰、0.0025mg五水硫酸铜、0.0212mg钼酸钠、0.0014mg氯化钴、0.083mg碘化钾、3.73mg乙二胺四乙酸二钠、2.78mg七水硫酸亚铁、0.2mg甘氨酸、0.05mg烟酸、0.01mg盐酸硫胺素、0.05mg盐酸吡哆醇、10mg肌醇,余量为蒸馏水，ph5.8。以及，1/3ms基础培养基每升含30g蔗糖、6.5g琼脂、0.2g活性炭、硝酸钾63.3mg硝酸钾、55mg硝酸铵、6mg硫酸镁、5.7mg磷酸二氢钾、11mg氯化钙、0.29mg七水硫酸锌、0.33mg硼酸、0.94mg四水硫酸锰、0.0008mg五水硫酸铜、0.0071mg钼酸钠、0.0005mg氯化钴、0.0277mg碘化钾、1.24mg乙二胺四乙酸二钠、0.93mg七水硫酸亚铁、0.07mg甘氨酸、0.017mg烟酸、0.003mg盐酸硫胺素、0.017mg盐酸吡哆醇、3.33mg肌醇，余量为蒸馏水，ph5.8；1/2ms基础培养基参照步骤a，培养条件参照步骤a。统计种子萌发率。
38.s3丛芽增殖：将萌发后叶片分化的小苗接种到增殖培养基上，增殖培养基包含1/2ms基础培养基、另附加0—0.5mg萘乙酸(naa)、0.5—2.5mg6-苄氨基腺嘌呤(6-ba),余量为蒸馏水，ph5.8。1/2ms基础培养基及培养条件参照步骤a。60天后统计增殖率。
39.s4生根壮苗：将增殖后约同等大小的蒙自兰小苗接种到不同的壮苗培养基上，壮苗培养基包含1/2ms基础培养基、另附加0—1mg萘乙酸(naa)、0—100g香蕉匀浆、0—100g土豆匀浆、0—100ml椰青，余量为蒸馏水，ph5.8。1/2ms基础培养基及培养条件参照步骤a。60天后测量生根数量、根长和苗高。
40.s5移栽：将生根壮苗后的蒙自兰瓶苗转移到温室内，5—7天后将无菌苗从培养瓶中取出，冲洗掉植株上残留的培养基，将幼苗种植在树皮:草炭:兰石为1:2:1的介质中，置于温室内遮阴处，室温不超过28℃，保持湿度60％—70％，幼苗存活率可达90％以上，待植株稳定生长后可进行常规水肥养护。
41.另外，s2-s4环境条件具体为：温度:23—27℃，光照强度：2000—2500lux，光源：led灯白光，光照时长：12小时/天，湿度：50％—70％。更优选的，该步骤的环境条件为温度为24—26℃，光照强度2000lx。
42.在步骤s5中，优选的，环境条件具体为：温度:22—28℃，自然光照强度：3000—5000lux，湿度：60％—70％。
43.可选的，在所培养的人工苗移栽之前，对瓶苗尝试催花：将丛芽增殖后约同等大小
的蒙自兰小苗接种到催花培养基上待其开花。该催花培养基包含0—2mg/l6-ba、0—0.5mg/lnaa、0—0.5mg/ltdz、0—0.5mg/l2,4-d以及0—1mg/lpp333，0—30g/l香蕉匀浆(其中tdz是噻苯隆，2,4-d是2，4-二氯苯氧乙酸，pp333是多效唑)。
44.执行上述实施方案得到以下实验数据：
45.表1不同成熟度种子萌发率
[0046][0047]
其中，共4组处理a1—a4，每个处理接种10瓶，每瓶约100粒种子，分别记录萌发时间并统计萌发率。萌发率＝萌发种子数量/接入种子总数
×
100％。根据表1可以得出种子最佳播种时间，蒙自兰种子的成熟度对其萌发率有显著影响。授粉后85d至105d的种子萌发所需时间均在30d左右，随着天数增加萌发率逐渐递增，但差别不显著。105d的种子萌发率最高为87％，显著高于115d的种子萌发率。
[0048]
表2不同培养基对蒙自兰种子萌发的影响
[0049][0050][0051]
注：表中萌发率为平均值
±
标准误；同列不同字母表示在p＝0.05水平上具有显著差异
[0052]
设置20个处理b1—b20，每个处理接种5瓶，每瓶100粒种子，待种子萌发后统计萌发率。根据表2可以得出种子萌发最佳培养基，成熟度为105d的蒙自兰种子播种在不同培养基上，所试验的20组培养基均能萌发，但各组萌发率有显著差异。b15处理的培养基1/2ms+
0.6mg/l naa+1mg/l 6-ba的萌发率最高为97％。1/2ms作为基础培养基的萌发率高于ms和1/3ms作为基础培养基的萌发率。后续，持续观察种子萌发后的蒙自兰幼苗，1/2ms作为基础培养基上的幼苗相对生长更好。所以，为更好的对比，均采用1/2ms作为后续丛芽增殖、壮苗生根以及催花对比实验的基础培养基。
[0053]
表3不同激素浓度配比对蒙自兰丛芽增殖的影响
[0054][0055]
注：表中萌发率为平均值
±
标准误；同列不同字母表示在p＝0.05水平上具有显著差异
[0056]
根据表3可以得出丛芽增殖最佳培养基，16组处理下的蒙自兰丛芽均具有不同程度的增殖，未添加naa和6-ba的培养基c16显著低于添加激素的培养基，c2和c4显著高于其他处理，两组处理均未添加naa。c4培养基为1/2ms+2mg/l 6-ba，增殖率最高，为47.33％，其6-ba浓度为2mg/l；c5增殖率最低为18.01％，其6-ba浓度为2.5mg/l，两组处理均未添加naa。
[0057]
表4不同浓度naa及营养物对蒙自兰幼苗生长的影响
[0058][0059]
注：表中萌发率数据为平均值
±
标准误；同列不同字母表示在p＝0.05水平上具有显著差异
[0060]
根据表4可以得到生根壮苗最佳培养基，将蒙自兰丛芽接种到d1—d17培养基，其中，d15培养基1/2ms+1mg/l naa+30g/l土豆匀浆的蒙自兰生长状况最佳，苗高、根长和根的数量都显著高于其他处理，其次为d14。30g/l的土豆生根最佳，其次10g/l，土豆质量超过30g/l反而抑制生根；30ml/l、50ml/l的椰青和100g/l的香蕉也有利于生根，但效果比土豆较差。naa对苗高的影响大于营养物的影响，1mg/l的naa有助于幼苗茎叶生长，d14、d15苗的平均高度显著高于其他处理。
[0061]
除此之外，还进行了不同激素浓度配比对蒙自兰试管开花的影响的实验，具体如下：
[0062]
表5不同激素浓度配比对蒙自兰试管开花的影响
[0063]
[0064][0065]
注：表中萌发率数据为平均值
±
标准误；同列不同字母表示在p＝0.05水平上具有显著差异
[0066]
在蒙自兰生根壮苗试验中发现，添加了30g/l香蕉匀浆培养基上的幼苗有部分开花现象，故在试管开花实验培养基中添加30g/l香蕉匀浆来促进其开花，e17对照组不添加。将生长健壮、苗高一致的蒙自兰幼苗接种到e1—e17的培养基上，观察不同激素对幼苗花芽分化的影响,共17个处理，每组5个重复25苗，90天后统计开花率和正常花率。开花率＝开放花朵数/接种外植体数
×
100％正常花率＝正常花朵数/开放花朵数
×
100％。从表5可知，在添加pp333的条件下，e2处理的花芽分化率和正常开花率都显著高于其他处理，是最优催花培养基。观察花芽分化情况发现，e1、e2、e3培养基的蒙自兰花梗都较长且大多开花株有2—4朵花，而其他组培养基的开花株均为1梗1朵；e17对比e1发现未添加pp333的培养基幼苗无花芽分化；当添加的6-ba浓度相同时，除e6未开花，naa与6-ba组合花芽分化率显著优于2,4-d与6-ba的组合，且花朵畸形率也较低；含2,4-d的培养基除e16外，花芽分化率都显著低于其他处理，且花朵畸形率较高；tdz对蒙自兰花芽分化也有促进作用，但效果不如6-ba，0.5mg/l的tdz作用显著高于0.1mg/l的tdz，但其花朵畸形率要高于含6-ba的培养基，可见添加tdz会增加蒙自兰花朵畸形率，而2,4-d对蒙自兰花芽分化有一定的抑制作用。e12添加
了0.5mg/l tdz和0.5mg/l naa的培养基上幼苗的开花状态，花梗短且花瓣卷曲；e14添加了0.1mg/ltdz和0.5mg/l 2,4-d培养基上幼苗的开花状态，花梗短且花朵呈闭合状态直至凋谢。实施例实验的对比表格中，没有添加香蕉匀浆显示没有开花，但香蕉匀浆的添加与否并非蒙自兰开花的决定因素，没有在培养基中添加香蕉匀浆的蒙自兰，形成的花芽和开花率只是相对更差。
[0067]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。