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茄子隐花色素基因SmCRY2及其用途.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-05-16 06:11

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511004885.3 (22)申请日 2015.12.28 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人上海交通大学地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人刘杨蒋明敏任丽陈火英 (74)专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司 31236 代理人郭国中陈少凌 (54) 发明名称茄。

2、子隐花色素基因 SmCRY2 及其用途 (57) 摘要本发明公开一种茄子隐花色素基因 SmCRY2 及其用途，所述基因的 cDNA 序列包括： (a) 如 SEQ ID NO.1 第 1 1944 位所示的碱基序列；或 (b) 与 SEQ ID NO.1 第 1 1944 位所示的碱基序列具有至少 70的同源性的碱基序列；或 (c) 能与 SEQ ID NO.1 第 1 1944 位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。所述基因编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 中所示。该基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，根和叶中的表达量显著高于其他组织。本发明为。

3、今后利用基因工程技术改良植物在弱光中生长不良提供理论依据，具有很大的应用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表7页附图3页 CN 105440116 A 2016.03.30 CN 105440116 A 1.一种茄子CRY2蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。 2.一种编码权利要求1所述茄子CRY2蛋白的SmCRY2基因，其特征在于，所述SmCRY2基因的cDNA序列包括： (a)如SEQIDNO.1第11944位所示的碱基序列；或 (b)与SEQIDNO.。

4、1第11944位所示的碱基序列具有至少70的同源性的碱基序列；或 (c)能与SEQIDNO.1第11944位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。 3.如权利要求2所述的SmCRY2基因，其特征在于，所述cDNA序列包括SEQIDNO.1第1 1944位所示的核酸序列中190个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5 和/或3 端添加 60个以内核苷酸。 4.一种用于扩增权利要求2所述的SmCRY2基因的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.3、 SEQIDNO.4所示。 5.一种如权利要求2所述的SmCRY2基因在植物组织中表达量的定量分析方法，其特征在于，。

5、所述方法包括如下步骤： S1、获得植物组织，提取其总RNA； S2、以所述总RNA为模板，反转录获得cDNA； S3、以cDNA第一条链为模板，分别用SmCRY2基因与内参基因Actin(GU984779.1)的特异性引物扩增进行荧光定量分析，获得所述SmCRY2基因在植物组织中表达量；所述扩增SmCRY2基因的特异性引物的碱基序列如SEQIDNO.5、 SEQIDNO.6所示；所述扩增内参基因Actin(GU984779.1)的碱基序列如SEQIDNO.7、 SEQIDNO.8所示。 6.一种如权利要求2所述的SmCRY2基因在基因工程改良植物品质中的用途。 7.根据。

6、权利要求6所述的用途，其特征在于，所述基因工程改良植物品质指的是基因工程改良植物在弱光中生长不良。 8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物包括拟南芥。权利要求书 1/1 页 2 CN 105440116 A 2 茄子隐花色素基因SmCRY2及其用途技术领域 0001 本发明属于生物技术领域，涉及茄子光信号通路中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种茄子隐花色素基因SmCRY2及其用途。背景技术 0002 蓝光和近紫外光可以使植物产生蓝光反应，隐花色素在植物中的主要作用就是作为蓝光和近紫外光的受体，来调节植物的生长发育。在拟南芥中存在3个隐花色素基因 CRY。

7、1， CRY2和CRY3，其中研究比较多的主要是CRY1和CRY2。 CRY1和CRY2蛋白在蓝光照射条件下发生磷酸化，这种磷酸化是特异的依赖于蓝光并随着蓝光光强的增强而增加，而红光和远红光并没有这种效果。 CRY1和CRY2蛋白的磷酸化和其功能发挥也是密切相关的，筛选到的CRY1和CRY2功能缺失的cry1和cry2突变体中，有多数是因为突变位点干扰了CRY蛋白的磷酸化。 0003 对隐花色素CRY2生理功能的了解主要是通过分析其功能缺失突变体cry2实现的，对其表型分析显示， cry2突变体在高光强蓝光下其下胚轴长度与野生型差别不大，但在弱蓝光条件下， cry2突变。

8、体的下胚轴长度比野生型的稍长。另外， cry2单突变体的子叶面积比野生型的小，说明CRY2参与了子叶面积扩展的调控。 cry2突变体另外一个显著的表型就是表现为开花时间的延迟，暗示了CRY2参与到了光周期开花过程的调控。 0004 目前已从很多植物中克隆得到CRY基因，如拟南芥、大豆、玉米、番茄等。茄子是重要的蔬菜作物，但相关研究相对比较滞后。目前，未有任何与茄子CRY2基因及其编码蛋白的相关文献报道。发明内容 0005 本发明的目的在于填补茄子CRY2基因的空白，提供一种茄子CRY2的cDNA以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子SmCRY2基因在。

9、不同组织器官的表达模式。本发明还提供了SmCRY2转入拟南芥后表型发生改变的结果。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 0007 第一方面，本发明涉及一种茄子CRY2蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2 所示。 0008 第二方面，本发明涉及一种编码茄子CRY2蛋白的SmCRY2基因，所述SmCRY2基因的 cDNA序列包括： 0009 (a)如SEQIDNO.1第11944位所示的碱基序列；或 0010 (b)与SEQIDNO.1第11944位所示的碱基序列具有至少70的同源性的碱基序列；或 0011 (c)能与SEQIDNO.1第11944位所示的。

10、碱基序列进行杂交的碱基序列。 0012 优选的，所述cDNA序列包括SEQIDNO.1第11944位所示的核酸序列中190个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5 和/或3 端添加60个以内核苷酸。说明书 1/5 页 3 CN 105440116 A 3 0013 第三方面，本发明涉及一种用于扩增SmCRY2基因的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.3、 SEQIDNO.4所示。 0014 第四方面，本发明涉及一种SmCRY2基因在植物组织中表达量的定量分析方法，所述方法包括如下步骤： 0015 S1、获得植物组织，提取其总RNA； 0016 S2、以所述。

11、总RNA为模板，反转录获得cDNA； 0017 S3、以cDNA第一条链为模板，分别用SmCRY2基因与内参基因Actin(GU984779.1)的特异性引物扩增进行荧光定量分析，获得所述SmCRY2基因在植物组织中表达量； 0018 所述扩增SmCRY2基因的特异性引物的碱基序列如SEQIDNO.5、 SEQIDNO.6所示；所述扩增内参基因Actin(GU984779.1)的碱基序列如SEQIDNO.7、 SEQIDNO.8所示。 0019 第五方面，本发明涉及一种SmCRY2基因在在基因工程改良植物品质中的用途。 0020 优选的，所述基因工程改良植物品质指的是基因工程。

12、改良植物在弱光中生长不良。 0021 优选的，所述植物包括拟南芥、大豆、玉米或番茄。 0022 在本发明中，术语 “SmCRY2基因编码序列” 指SEQIDNO.1所示的第11944位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.1所示的第11944位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.1所示的第11944位核苷酸序列同源性低至约70的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70的核苷酸序列。。

13、 0023 该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmCRY2相同功能的蛋白的SEQIDNO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为190个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5 和/或3 端添加为60个以内核苷酸。 0024 在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmCRY2基因产物的表达模式，即分析茄子SmCRY2基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。 0025 此外，根据本发明的茄子SmCRY2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmCRY2相关同源基因或同源蛋白。 0026 为了得到与茄。

14、子SmCRY2相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对茄子SmCRY2相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自 Clontech， Stratagene， PaloAlto， Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmCRY2相关的基因家族的核苷酸序列。 0027 本发明的茄子SmCRY2相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成。

15、的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR 扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。 0028 当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其说明书 2/5 页 4 CN 105440116 A 4 克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 0029 此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列。

16、中。 0030 光信号能调控许多次生代谢途径，例如花青素的合成。茄子是广泛种植的蔬菜作物，紫色茄子的果皮含有丰富的花青素。近年来的研究结果表明，紫色茄子的抗氧化保健作用在常见蔬菜作物中是最好的。因此，本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，克隆蓝光受体SmCRY2基因，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。附图说明 0031 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显； 0032 图1为本发明的茄子CRY2蛋白与番茄CRY2蛋白的氨基酸序列同源比较。

17、(FASTA)结果；其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出； 0033 图2为本发明的茄子CRY2基因在不同组织的表达情况； 0034 图3为转SmCRY2基因植株的RT-PCR检测； 0035 图4为转SmCRY2基因对拟南芥突变株cry2-1的表型恢复情况； 0036 图5为转SmCRY2基因对拟南芥突变株crv2-1的开花情况的影响。具体实施方式 0037 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出。

18、若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆：实验室手册(NewYork： ColdSpringHarborLaboratoryPress， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 0038 实施例1、茄子SmCRY2基因的克隆 0039 1.植物材料的获得 0040 本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子的叶片用于提取RNA。 0041 2.RNA的提。

19、取 0042 采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(ThermoScientificNANODROP1000 Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。 0043 3.基因的全长克隆 0044 基于Genbank中CRY2基因的保守序列设计一对简并引物。将提取RNA进行反转录 (PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物 0045 F1(SEQIDNO.3)： 5。

20、 -ATGGAGAKSAAYTMCAAGACWATTGT-3 说明书 3/5 页 5 CN 105440116 A 5 0046 R1(SEQIDNO.4)： 5 -TCATCSYRTYGTAGYTTCAYTTTTGC-3 0047 进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5 ，利用互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海) 贸易有限公司进行测序，得cDNA序列SEQIDNO.1。 0048 实施例2、茄子CRY2基因的序列信息与同源性分析 0049 本发明新的茄子CRY2基因全长CDS开放读框序列为。

21、1944bp，详细序列见SEQID NO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子CRY2的氨基酸序列，共647个氨基酸残基，分子量为73208.5道尔顿，理论等电点(pI)为5.91，详细序列见SEQIDNO.2所示序列。 0050 将茄子CRY2的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non- redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+ SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与番茄 CRY2基因(NM。

22、_001247316.1)在核苷酸水平上具有92.28一致性；在氨基酸水平上，它们两者之间相似性高达92.59，如图1所示(Query：茄子CRY2的氨基酸序列； Sbjct：番茄CRY2的氨基酸序列)。由此可见，茄子CRY2基因与番茄CRY2基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。 0051 实施例3、茄子CRY2基因在不同组织中的表达 0052 1.植物材料的获得 0053 在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80超低温冰箱中贮存待用。 0054 2.RNA的提取 0055 采用。

23、TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2； 0.5TBE电泳缓冲液； 150v， 15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA， A260/A280以及A260/A230约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。 0056 3.cDNA的获得 0057 以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKit PerfectRealTime试剂盒操作。

24、说明进行反转录获得cDNA备用。 0058 4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子CRY2基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-timePCR中SmCRY2基因定量分析的特异性引物， 0059 CRY2-F： 5 -CCTTGCCCGAGCAGTTCATCTTAT-3 (SEQIDNO.5) 0060 CRY2-R： 5 -GAACACAAGTCACCGTCCACGT-3 (SEQIDNO.6) 0061 内参基因为Actin(GU984779.1)，其引物为 0062 ACTIN-F： 5 -GTCGGAATGGGACAGA。

25、AGGATG-3 (SEQIDNO.7) 0063 ACTIN-R： 5 -GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3 (SEQIDNO.8) 0064 5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASYDilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-timePCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单说明书 4/5 页 6 CN 105440116 A 6 一的PCR扩增产物。

26、。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。 0065 6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析， Real-timePCR反应在 FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20 L。反应采用三步法， 95变性1min，接着40个循环： 9530s； 5830s； 7245s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。 0066 7.采用2- Ct法作相对定量分析。结果表明SmCRY2基因在茄子的根、茎、叶、花、果皮、果肉中都有表达，其中在根和。

27、叶中的表达量最高，其次是花和茎，而在果肉中的表达量较低，说明SmCRY2基因的表达具有明显的空间差异性(图2)。 0067 实施例4、茄子CRY2基因转型南芥的功能验证 0068 所用转化载体为pCAMBIA1302(Cambia)，拟南芥材料为CRY2突变株cry2-1(Lian eta1.2011.Blue-light-dependentinteractionofcryptochrome1withSPA 1definesadynamicsignalingmechanism.GenesDev.25： 1023-1028)。将含有SmCRY2- 1302的农杆菌培养至OD0.82。

28、.0， 6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用MS液重悬，调整 OD600为0.81.2，侵染拟南芥花序1060sec，暗培养12h后正常培养，收集成熟的种子。 0069 收集的T0代转基因种子，铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上， 4春化3d，光照培养箱培养6-10d，选取根长的长，且长出真叶的健壮幼苗，移栽至土盆，培养。收集的T1 代种子继续铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，选取抗性：不抗比为31的株系收集 T2代种子。 T2代在50mg/L潮霉素抗性平板上存活率为100的认为筛选到纯和抗性植株。对获得的株系采用Real。

29、-timePCR检测SmCRY2的表达量(图4)。所用拟南芥actin(NM_179953) 引物如下： 0070 5 -GTCTGGATTGGAGGGTC-3 (SEQIDNO.9) 0071 5 -TGAGAAATGGTCGGAAA-3 (SEQIDNO.10) 0072 将筛选得到的阳性转化株同突变株，野生型一同置于蓝光下培养(3mol/m2/ sec)。结果显示， cry2-1在蓝光下的下胚轴略高于野生型WT(图4)，且其开花时间显著晚于野生型(图5)，而转基因植株SmCRY2/cry2-1恢复了这两个表型(图4， 5)。这说明茄子CRY2基因具有与拟南芥CRY2基因相。

30、似的功能。 0073 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。说明书 5/5 页 7 CN 105440116 A 7 0001 0002 序列表 1/7 页 8 CN 105440116 A 8 序列表 2/7 页 9 CN 105440116 A 9 0003 序列表 3/7 页 10 CN 105440116 A 10 0004 0005 序列表 4/7 页 11 CN 105440116 A 11 0006 序列表 5/7 页 12 CN 105440116 A 12 0007 序列表 6/7 页 13 CN 105440116 A 13 序列表 7/7 页 14 CN 105440116 A 14 图1 说明书附图 1/3 页 15 CN 105440116 A 15 图2 图3 说明书附图 2/3 页 16 CN 105440116 A 16 图4 图5 说明书附图 3/3 页 17 CN 105440116 A 17 。