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女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法、多指标成分含量检测方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-05-12 15:59

1.本发明涉及中药材质量检测技术领域，特别是涉及一种女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法、多指标成分含量检测方法，以及女贞子药材及其炮制品的特征图谱和多指标成分含量同步检测方法。

背景技术：

2.女贞子为木犀科植物女贞ligustrum lucidum ait.的干燥成熟果实。冬季果实成熟时采收，除去枝叶，稍蒸或置沸水中略烫后，干燥；或直接干燥。味甘、苦，性凉。归肝、肾经。具有滋补肝肾，明目乌发的功效，用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，内热消渴，骨蒸潮热等症。中国药典2020年版收录有女贞子和酒女贞子，中医理论认为，女贞子以清肝明目、滋阴润燥为主，多用于肝热目眩、阴虚肠燥便秘等症；而酒能活血通络、祛风散寒，故炮制后的酒女贞子滋补肝肾作用较女贞子强，寒凉之性减弱，多用于肝肾阴虚、头晕耳鸣、视物不清、须发早白等症，中医临床中常以酒女贞子应用为主。
3.女贞子化学成分主要包含萜类、环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、黄酮类、挥发油、脂肪酸几大类，此外还有多糖、微量元素；其中最具活性成分和药用价值的属三萜类、环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类，其各自代表成分为齐墩果酸、特女贞苷和红景天苷等。现代研究发现，女贞子炮制过程中，其化学成分和药理作用都发生了一定程度的变化，而中国药典2020年版中仅规定了女贞子中特女贞苷不得少于0.7％，酒女贞子中红景天苷含量不得少于0.2％的单指标含量限度要求，缺少女贞子药材及其炮制品酒女贞子的整体质量控制方法。同时，不同炮制程度的女贞子药材中活性成分的差异也较为明显，进而影响女贞子炮制品功效的发挥，因此有必要对不同炮制程度的女贞子药材进行有效鉴别。
4.有传统方法涉及女贞子生品和酒制品的鉴别，以10
‑
羟基
‑
木樨榄苷二甲酯、新女贞苷或异构体、8
‑
demethyl
‑7‑
ketologanin、elenolic acid、毛蕊花糖苷、木樨草素中的一种或至少两种作为标志物；同时，提供了采用超高效液相色谱/四极杆
‑
轨道阱质谱(uhplc/q
‑
orbitrap
‑
ms)对样品进行分离和检测，可有效分离女贞子样品并进行检测，即可准确判断样品是否为生品或酒制品。但是该传统方法仅能够对生品和市售的酒制成品进行鉴别，难以反映炮制程度不同导致的酒制品质量的差异。
5.还有传统方法涉及女贞子与酒女贞子hplc指纹图谱对比研究，以乙腈
‑
0.1％磷酸水为流动相按照一定的洗脱梯度进行洗脱，构建获得女贞子与酒女贞子hplc指纹图谱，并筛选得到11个主要差异性物质，其中包含羟基酪醇、酪醇、特女贞苷、橄榄苦苷、槲皮素。但是该传统方法也仅能够对生品和市售的酒制成品进行鉴别，难以反映炮制程度不同导致的酒制品质量的差异，且检测时间长达1个小时，检测效率低，难以适应炮制生产的高效性。

技术实现要素：

6.基于此，本发明提供一种能够高效地鉴别女贞子药材及其不同炮制程度的炮制品
的女贞子及其炮制品的特征图谱构建方法。
7.本发明的第一方面，提供一种女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
8.制备对照品溶液和供试品溶液，其中，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取5
‑
羟甲基糠醛对照品、红景天苷对照品、松果菊苷对照品、特女贞苷对照品和女贞苷g13对照品，加第一溶剂溶解；所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取女贞子药材或其炮制品，加第二溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液；
9.将所述对照品溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相a为乙腈，流动相b为水；洗脱方式为梯度洗脱。
10.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
11.0～5min，流动相a的体积百分比由2％上升至10％，所述流动相b的体积分数由98％下降到90％；
12.5～9min，流动相a的体积百分比由10％上升至18％，所述流动相b的体积分数由90％下降到82％；
13.9～11min，流动相a的体积百分比由18％上升至24％，所述流动相b的体积分数由82％下降到76％；
14.11～24min，流动相a的体积百分比由24％上升至28％，所述流动相b的体积分数由76％下降到72％；
15.24～25min，流动相a的体积百分比由28％下降到2％，所述流动相b的体积分数由72％上升至98％。
16.在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的检测条件还包括：
17.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：0min～3min，检测波长为268nm～285nm，3min～25min，检测波长为224nm～275nm；流速：0.2ml/min～0.3ml/min；柱温：25℃～32℃。
18.在其中一个实施例中，所述供试品溶液的制备方法中，
19.所述第二溶剂为甲醇或甲醇与水的混合液；及/或
20.所述第二溶剂的用量为每0.3g所述女贞子药材或其炮制品加10ml～75ml；及/或
21.提取的方法为超声提取或加热至回流提取，提取的时间为30min～60min。
22.在其中一个实施例中，所述女贞子药材的特征图谱包含10个共有峰，10个共有峰中包括红景天苷、松果菊苷、特女贞苷和女贞苷g13的特征峰；所述女贞子炮制品的特征图谱在所述女贞子药材的特征图谱的基础上新增1～4个共有峰，新增的1～4个共有峰中包括5
‑
羟甲基糠醛的特征峰。
23.本发明的第二方面，提供一种女贞子药材及其炮制品的多指标成分含量检测方法，包括如下步骤：
24.制备指标成分对照品溶液和待测品溶液，其中，所述指标成分对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取红景天苷对照品、特女贞苷对照品和女贞苷g13对照品，加第三溶剂溶解，配制成不同浓度的指标成分对照品溶液；所述待测品溶液的制备方法包括如下步骤：取待测女贞子药材或其炮制品，加第二溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液；
25.将所述不同浓度的指标成分对照品溶液进行超高效液相色谱检测，构建指标成分
的标准曲线；将所述待测品溶液进行超高效液相色谱检测，根据检测结果与所述指标成分的标准曲线计算指标成分含量；
26.所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相a为乙腈，流动相b为水；洗脱方式为梯度洗脱。
27.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
28.0～5min，流动相a的体积百分比由2％上升至10％，所述流动相b的体积分数由98％下降到90％；
29.5～9min，流动相a的体积百分比由10％上升至18％，所述流动相b的体积分数由90％下降到82％；
30.9～11min，流动相a的体积百分比由18％上升至24％，所述流动相b的体积分数由82％下降到76％；
31.11～24min，流动相a的体积百分比由24％上升至28％，所述流动相b的体积分数由76％下降到72％；
32.24～25min，流动相a的体积百分比由28％下降到2％，所述流动相b的体积分数由72％上升至98％。
33.在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的检测条件还包括：
34.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：0min～3min，检测波长为268nm～285nm，3min～25min，检测波长为224nm～275nm；流速：0.2ml/min～0.3ml/min；柱温：25℃～32℃。
35.在其中一个实施例中，所述待测品溶液的制备方法中，
36.所述第二溶剂为甲醇或甲醇与水的混合液；及/或
37.所述第二溶剂的用量为每0.3g所述女贞子药材或其炮制品加10ml～75ml；及/或
38.提取的方法为超声提取或加热至回流提取，提取的时间为30min～60min。
39.本发明的第三方面，提供一种女贞子药材及其炮制品的特征图谱和多指标成分含量同步检测方法，包括如下步骤：
40.按照如上所述的特征图谱构建方法构建所述女贞子药材及其炮制品的特征图谱；
41.按照如上所述的多指标成分含量检测方法构建所述指标成分的标准曲线；
42.待测样品溶液的制备：取待测女贞子药材或其炮制品，加第二溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液；
43.将所述待测样品溶液进行超高效液相色谱检测，根据检测结果与所述女贞子药材及其炮制品的特征图谱、所述指标成分的标准曲线获得检测结果；
44.所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相a为乙腈，流动相b为水；洗脱方式为梯度洗脱。
45.在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
46.0～5min，流动相a的体积百分比由2％上升至10％，所述流动相b的体积分数由98％下降到90％；
47.5～9min，流动相a的体积百分比由10％上升至18％，所述流动相b的体积分数由90％下降到82％；
48.9～11min，流动相a的体积百分比由18％上升至24％，所述流动相b的体积分数由
82％下降到76％；
49.11～24min，流动相a的体积百分比由24％上升至28％，所述流动相b的体积分数由76％下降到72％；
50.24～25min，流动相a的体积百分比由28％下降到2％，所述流动相b的体积分数由72％上升至98％。
51.在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的检测条件还包括：
52.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：0min～3min，检测波长为268nm～285nm，3min～25min，检测波长为224nm～275nm；流速：0.2ml/min～0.3ml/min；柱温：25℃～32℃。
53.在其中一个实施例中，所述待测样品溶液的制备方法中，
54.所述第二溶剂为甲醇或甲醇与水的混合液；及/或
55.所述第二溶剂的用量为每0.3g所述女贞子药材或其炮制品加10ml～75ml；及/或
56.提取的方法为超声提取或加热至回流提取，提取的时间为30min～60min。
57.本发明的构建方法通过采用合适的uplc色谱条件能够同时建立女贞子药材及其不同炮制程度的炮制品的特征图谱，且女贞子特征图谱中包含10个特征峰，炮制品特征图谱新增1～4个特征峰，能够全面地反映女贞子药材及其不同炮制程度的炮制品的质量，且该方法稳定且专属性强，准确可靠、操作简便、重现性好，为女贞子药材质量控制及炮制品炮制过程控制提供了科学的检测和鉴别方法。同时，该构建方法用时较短，检测效率高，能够适应炮制生产的高效性，便于大规模推广应用。
58.本发明的多指标成分含量检测方法通过采用合适的uplc色谱条件能够对女贞子药材及其炮制品中的红景天苷、特女贞苷和女贞苷g13指标成分进行准确定量，结果可靠、操作简便，弥补了中国药典2020年版未能同时检测女贞子药材及其炮制品种特女贞苷含量和红景天苷含量的空白，且同时增加了含量较高的女贞苷g13指标测定。
59.进一步的，本发明通过采用合适的uplc色谱条件，能够同时实现前述女贞子药材及其不同炮制程度的炮制品的特征图谱的构建以及其中多指标成分含量检测，有利于全面对女贞子药材及其不同炮制程度的炮制品进行质量控制，适应工业化高效生产，且方法操作简便、精密度高、准确度高、稳定性好、重现性好，便于大规模推广应用。
附图说明
60.图1为本发明实施例1中11批女贞子药材的特征图谱及其对照特征图谱；
61.图2为本发明实施例1中女贞子饮片压破后酒蒸8小时内的炮制过程特征图谱；
62.图3为本发明实施例1中女贞子饮片不压破酒蒸8小时内的炮制过程特征图谱；
63.图4为本发明实施例1中女贞子饮片不压破酒炖8小时内的炮制过程特征图谱；
64.图5为实施例1中混合对照品的色谱图(峰11:5
‑
羟甲基糠醛；峰3:红景天苷；峰4:松果菊苷；峰7:特女贞苷；峰9:女贞苷g13)；
65.图6为实施例1中不同酒女贞子炮制品14个特征峰的pda得分图；
66.图7为实施例1中不同酒女贞子炮制品14个特征峰的opls
‑
da得分图；
67.图8为实施例1中女贞子药材及其炮制饮片的特征图谱的专属性考察图谱；
68.图9为实施例1中洗脱梯度一和检测波长275nm考察图谱；
69.图10为实施例1中洗脱梯度一和检测波长224nm考察图谱；
70.图11为实施例1中洗脱梯度二和检测波长275nm考察图谱；
71.图12为实施例1中洗脱梯度二和检测波长224nm考察图谱；
72.图13为实施例1中检测波长275nm(0～3min)考察图谱；
73.图14为实施例1中检测波长284nm(0～3min)考察图谱；
74.图15为实施例1中提取溶剂考察图谱；
75.图16为实施例2中女贞子药材及其炮制饮片指标成分含量测定的专属性考察图谱；
76.图17为实施例2中女贞子药材及其炮制饮片指标成分红景天苷线性考察图谱；
77.图18为实施例2中女贞子药材及其炮制饮片指标成分特女贞苷线性考察图谱；
78.图19为实施例2中女贞子药材及其炮制饮片指标成分女贞苷g13线性考察图谱。
具体实施方式
79.以下结合具体实施例对本发明的女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
80.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
81.本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。
82.本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
83.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
84.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
85.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相
‑
固相混合均指质量百分比，对于液相
‑
液相混合指体积百分比，溶剂基质均为水。
86.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
87.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
88.本发明提供一种女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
89.制备对照品溶液和供试品溶液，其中，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取5
‑
羟甲基糠醛对照品、红景天苷对照品、松果菊苷对照品、特女贞苷对照品和女贞苷g13对照品，加第一溶剂溶解；所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取女贞子药材或其炮制品，加第二溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液；
90.将对照品溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，超高效液相色谱的检测条
件包括：采用的流动相a为乙腈，流动相b为水；洗脱方式为梯度洗脱。
91.在其中一些示例中，梯度洗脱包括如下程序：
92.0～5min，流动相a的体积百分比由2％上升至10％，流动相b的体积分数由98％下降到90％；
93.5～9min，流动相a的体积百分比由10％上升至18％，流动相b的体积分数由90％下降到82％；
94.9～11min，流动相a的体积百分比由18％上升至24％，流动相b的体积分数由82％下降到76％；
95.11～24min，流动相a的体积百分比由24％上升至28％，流动相b的体积分数由76％下降到72％；
96.24～25min，流动相a的体积百分比由28％下降到2％，流动相b的体积分数由72％上升至98％。
97.在其中一些示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：
98.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：0min～3min，检测波长为268nm～285nm，3min～25min，检测波长为224nm～275nm；流速：0.2ml/min～0.3ml/min；柱温：25℃～32℃。
99.在其中一些示例中，超高效液相色谱的检测波长为：0min～3min，检测波长为282nm～285nm，3min～25min，检测波长为224nm～230nm。
100.在其中一些示例中，超高效液相色谱的流速为0.2ml/min～0.3ml/min。具体的，流速包括但不限于：0.2ml/min、0.21ml/min、0.22ml/min、0.23ml/min、0.24ml/min、0.25ml/min、0.26ml/min、0.27ml/min、0.28ml/min、0.29ml/min、0.3ml/min。
101.在其中一些示例中，超高效液相色谱的柱温为25℃～32℃。具体的，柱温包括但不限于：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃。
102.在其中一些示例中，供试品溶液的制备方法中，第二溶剂为甲醇或甲醇与水的混合液。进一步地，甲醇与水的混合液中甲醇的体积分数为25％～80％。具体地，甲醇与水的混合液中甲醇的体积分数包括但不限于：25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、68％、70％、72％、75％、80％。
103.在其中一些示例中，供试品溶液的制备方法中，第二溶剂的用量为每0.3g女贞子药材或其炮制品加10ml～75ml。进一步地，第二溶剂的用量为每0.3g女贞子药材或其炮制品加入20ml～30ml。
104.在其中一些示例中，供试品溶液的制备方法中，提取的方法为超声提取或加热至回流提取。进一步地，超声的功率为450w～500w，频率为35khz～45khz。
105.在其中一些示例中，供试品溶液的制备方法中，提取的时间为30min～60min。具体地，提取的时间包括但不限于：30min、35min、40min、45min、50min、53min、55min、56min、57min、58min、59min、60min。
106.在其中一些示例中，对照品溶液的制备方法中，第一溶剂为醇类溶剂，如甲醇。
107.在其中一些示例中，对照品溶液和供试品溶液的进样量为0.5μl～1.5μl。
108.在其中一些示例中，女贞子药材的特征图谱包含10个共有峰，10个共有峰中包括红景天苷、松果菊苷、特女贞苷和女贞苷g13的特征峰；所述女贞子炮制品的特征图谱在所
述女贞子药材的特征图谱的基础上新增1～4个共有峰，新增的1～4个共有峰中包括5
‑
羟甲基糠醛的特征峰。
109.本发明还提供一种女贞子药材及其炮制品的多指标成分含量检测方法，包括如下步骤：
110.制备指标成分对照品溶液和待测品溶液，其中，指标成分对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取红景天苷对照品、特女贞苷对照品和女贞苷g13对照品，加第三溶剂溶解，配制成不同浓度的指标成分对照品溶液；待测品溶液的制备方法包括如下步骤：取待测女贞子药材或其炮制品，加入第二溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液；
111.将不同浓度的指标成分对照品溶液进行超高效液相色谱检测，构建指标成分的标准曲线；将待测品溶液进行超高效液相色谱检测，根据检测结果与所述指标成分的标准曲线计算指标成分含量；
112.超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相a为乙腈，流动相b为水；洗脱方式为梯度洗脱。
113.可以理解地，上述女贞子药材及其炮制品的多指标成分含量检测方法的技术方案类似前述女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法，其中，待测品溶液的制备同供试品溶液的制备，在此不再赘述。
114.本发明还提供一种女贞子药材及其炮制品的特征图谱和多指标成分含量同步检测方法，包括如下步骤：
115.按照如上所述的特征图谱构建方法构建所述女贞子药材及其炮制品的特征图谱；
116.按照如上所述的多指标成分含量检测方法构建所述指标成分的标准曲线；
117.待测样品溶液的制备：取待测女贞子药材或其炮制品，加入第二溶剂进行提取，提取液过滤，取续滤液；
118.将所述待测样品溶液进行超高效液相色谱检测，根据检测结果与所述女贞子药材及其炮制品的特征图谱、所述指标成分的标准曲线获得检测结果；
119.超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相a为乙腈，流动相b为水；洗脱方式为梯度洗脱。
120.可以理解地，上述女贞子药材及其炮制品的特征图谱和多指标成分含量同步检测方法的技术方案类似前述女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法，其中，待测样品溶液的制备同供试品溶液的制备，在此不再赘述。
121.本发明的实施例中采用的仪器和试药如下：
122.1、仪器
123.waters超高效液相色谱仪(沃特世公司，waters h
‑
class)，pda检测器(沃特世公司)；empower工作站；万分之一天平(梅特勒
‑
托利多公司，me204e)；百万分之一天平(梅特勒
‑
托利多公司，xp26)；超纯水机(默克公司，milli
‑
q direct 8/16system)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，kq5500de)；acquity uplc beh shield rp18 column色谱柱(100mm
×
2.1mm,1.7μm)。
124.2、试药
125.乙腈为色谱纯，水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
[0126]5‑
羟甲基糠醛对照品(批号：wkq20041311；来源：四川省维克奇生物科技有限公
司)；红景天苷对照品(批号：110818
‑
201507；来源：中国食品药品检定研究院；含量％：99.4)；松果菊苷对照品(批号：111670
‑
201907；中国食品药品检定研究院；含量％：91.8)；特女贞苷对照品(批号：111926
‑
201906；中国食品药品检定研究院；含量％：95.0)；女贞苷g13对照品(批号：8857；上海诗丹德标准技术服务有限公司；含量％：95.0)。
[0127]
实施例1
[0128]
本实施例为女贞子药材及其炮制饮片的uplc特征图谱建立方法。
[0129]
女贞子药材：采集来自河南、江苏、山东等产地共11批符合2020年版《中国药典》规定的女贞子药材。
[0130]
炮制饮片酒女贞子：取女贞子药材，除去杂质，均分三份，一份压破，得女贞子压破饮片，另两份为女贞子不压破饮片；取女贞子饮片置容器中，用相当于黄酒重量1倍的饮用水稀释黄酒，每100kg女贞子饮片用黄酒20kg，闷润2～4小时后，取出；一份女贞子压破饮片酒蒸8.0小时，另两份女贞子不压破饮片分别酒蒸和酒炖8小时；每隔0.5小时取样于烘箱中烘干，即得不同饮片规格和不同炮制时间下的酒女贞子饮片。其中，女贞子压破饮片酒蒸标记为yp
‑
jz，女贞子不压破饮片酒蒸标记为byp
‑
jz，女贞子不压破饮片酒炖标记为byp
‑
jd。
[0131]
1、色谱条件与系统适用性试验
[0132]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(acquity uplc beh shield rp18 column，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；0min～3min，检测波长为284nm，3min～25min，检测波长为224nm。理论板数按特女贞苷峰计算应不低于30000。
[0133]
表1梯度洗脱表
[0134][0135]
2、对照品溶液的制备
[0136]
取5
‑
羟甲基对照品、红景天苷对照品、松果菊苷对照品、特女贞苷对照品、女贞苷g13对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
[0137]
3、供试品溶液的制备
[0138]
取女贞子药材或酒女贞子饮片(yp
‑
jz、byp
‑
jz、byp
‑
jd)，并制成粉末(过三号筛)，取粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声(功率：500w，频率：40khz)处理60分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0139]
4、测定
[0140]
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪waters h
‑
class，测定，即得。
[0141]
5、测定结果
[0142]
(1)女贞子药材测定结果
[0143]
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对11批女贞子药材的特征图谱进行共有峰匹配，生成对照特征图谱，见图1，共确定了10个特征峰，对10个共有峰进行了化学成分的指认，确认3号峰为红景天苷峰，4号峰为松果菊苷峰，7号峰为特女贞苷峰，9号峰为女贞苷g13峰，以7号峰特女贞苷峰为参照峰s，制订了女贞子药材特征图谱分析方法的参考数据，从女贞子药材特有的特征图谱角度，选取特征峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，构成女贞子药材特征图谱的全貌。具体以峰7特女贞苷峰为参照峰，计算其余各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，实验结果如表2、3所示。
[0144]
表2 11批女贞子药材特征图谱的相对保留时间
[0145][0146]
表3 11批女贞子药材特征图谱的相对峰面积
[0147][0148][0149]
(2)酒女贞子炮制过程测定结果
[0150]
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对yp
‑
jz、byp
‑
jz及byp
‑
jd的8小时炮制过程中，每隔0.5小时取样的炮制饮片酒女贞子样品进行特征图谱分析，随着炮制时间的延长，新增1～4个特征峰，见图2、3、4，对1～14个共有峰进行了化学成分的指认，确认3号峰为红景天苷峰，4号峰为松果菊苷峰，7号峰为特女贞苷峰，9号峰为女贞苷g13峰，11号峰为5
‑
羟甲基糠醛峰，见图5。
[0151]
将测定后的酒女贞子饮片uplc特征图谱中色谱峰的峰面积进行主成分分析(pda)和偏正交最小二乘判别分析(opls
‑
da)，酒女贞子饮片中未检测到的1～4个新增的特征峰以0记其峰面积，将不同饮片规格和不同炮制方式中酒女贞子饮片标定的14个共有峰的峰面积导入simca14.0软件进行分析，pda和opls
‑
da得分图见图6、7。酒女贞子饮片yp
‑
jz与byp
‑
jz或byp
‑
jd在pda无监督模型中分类聚集明显，而酒女贞子饮片byp
‑
jz和byp
‑
jd则聚集一起。通过opls
‑
da有监督模型进一步分析，其r2y(表示opls
‑
da模型拟合程度)达到0.924，q2(表示该模型预测能力)达到0.889。表明不同饮片规格和不同炮制方式中酒女贞子饮片在opls
‑
da模型中分类聚集明显。
[0152]
酒女贞子炮制过程的uplc特征图谱测定结果显示，女贞子压破后加入黄酒闷润，随着酒蒸时间的延长，短时间内出现了新的色谱峰，即化学成分发生了转化与生成，且酒蒸1小时后就生成了14个特征峰；女贞子不压破直接加入黄酒闷润，酒蒸2小时后生成14个特征峰，而酒炖则需7.5小时后才生成14个特征峰；产生差异的主要影响因素为炮制过程中水汽直接接触与否，即压破后女贞子的种皮被破坏，酒蒸过程的水蒸气可直接与女贞子接触，高湿高热条件下易发生化学成分的转化与生成，而未压破的女贞子在果皮的保护下，减弱了高湿水蒸气的直接接触，其化学成分的转化与生成时间则延长，而酒炖则进一步隔绝了水蒸气的直接接触，化学成分的转化与生成时间进一步延长。结合pda和opls
‑
da模型进一步分析可知不同炮制条件下女贞子的化学成分转化与生成的比例情况也存在差异。
[0153]
综上所述，11批女贞子药材中分离度好且较稳定的特征图谱有10个共有峰。其中4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应，与特女贞苷参照物相对应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的
±
10％之内，规定值为0.32(峰1)、0.35(峰2)、0.93(峰5)、0.96(峰6)、1.11(峰8)、1.46(峰10)。而炮制饮片酒女贞子新增的1～4个特征峰中，其中1个峰应与相应对照品参照物峰的保留时间相对应，与特女贞苷参照物相对应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的
±
10％之内，规定值为0.80(峰12)、1.05(峰13)、1.18(峰14)。
[0154]
6、方法学验证
[0155]
(1)专属性试验
[0156]
取同一批制备的供试品溶液、空白溶剂、对照品溶液，在上述液相色谱条件下进行检测，每次进样1μl，记录色谱图。结果如图8所示，空白溶剂色谱中在与特征峰相应的保留时间位置上没有色谱峰，表明提取溶剂对各特征峰的测定无干扰，专属性良好。
[0157]
(2)精密度试验
[0158]
取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下重复进样6次，每次进样1μl，以特女贞苷峰为s峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值。各特征峰的相对保留时间的rsd均小于2％，相对峰面积的rsd小于3％，结果表明，仪器精密度良好。
[0159]
(3)重复性试验
[0160]
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液在上述液相色谱条件下进样测定，每次进样1μl，以特女贞苷峰为s峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值。各特征峰的相对保留时间的rsd均小于2％，相对峰面积的rsd小于3％，结果表明，本分析方法重复性良好。
[0161]
(4)稳定性试验
[0162]
取供试品溶液，于室温下放置，在上述液相色谱条件下，分别在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时进行检测，每次进样1μl，以特女贞苷峰为s峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值。各特征峰的相对保留时间的rsd均小于2％，相对峰面积的rsd小于5％，结果表明，24小时内供试品溶液的稳定性较好。
[0163]
7、色谱条件考察
[0164]
(1)洗脱梯度和检测波长
[0165]
1.1、洗脱梯度一
[0166]
以酒女贞子yp
‑
jz(8小时)按照“供试品溶液的制备”项进行供试品的制备，按照与“色谱条件与系统适用性试验”相同的条件，采用的检测波长为双波长224nm、275nm，洗脱梯度为如下表4洗脱梯度，进行洗脱梯度考察。
[0167]
表4
[0168][0169][0170]
结果参见图9和图10，可见，各色谱峰的出峰时间随着流动相的极性变大而变短，且各色谱峰出峰密集分离度差，表明此梯度条件下无法很好得到分离度好、各色谱峰保留时间适应的色谱图。
[0171]
1.2、洗脱梯度二
[0172]
以酒女贞子yp
‑
jz(8小时)按照“供试品溶液的制备”项进行供试品的制备，按照与“色谱条件与系统适用性试验”相同的条件，采用的检测波长为双波长224nm、275nm，洗脱梯度为如下表5洗脱梯度，进行洗脱梯度考察。
[0173]
表5
[0174][0175]
结果参见图11和图12，可见，对比梯度洗脱一的色谱图，各色谱峰的出峰时间适中且分离度较好；另对比224nm和275nm波长下的色谱图可知，224nm波长下各色谱峰吸收大，峰型较好，但在0～3min内，缺失275nm波长下的部分色谱峰，且通过对照品比对，其中缺失的峰包含5
‑
羟甲基糠醛(即在224nm波长下不具有吸收)，需进一步考察检测波长对5
‑
羟甲基糠醛吸收大小的影响。
[0176]
1.3检测波长
[0177]
以酒女贞子yp
‑
jz(8小时)按照“供试品溶液的制备”项进行供试品的制备，按照与“色谱条件与系统适用性试验”相同的条件，仅改变洗脱0～3min过程中的检测波长，分别为275nm、284nm。
[0178]
结果如图13～14所示。由此可见，0～3min内的11号峰5
‑
羟甲基糠醛在284nm检测波长下的吸收(峰面积)大于275nm波长，见下表6～7。
[0179]
表6保留时间
[0180][0181]
表7峰面积
[0182][0183]
(2)供试品制备中提取溶剂考察
[0184]
按照与“色谱条件与系统适用性试验”相同的条件，以酒女贞子yp
‑
jz(8小时)按照“供试品溶液的制备”项进行供试品的制备，仅改变供试品制备中提取溶剂进行提取溶剂考察。考察的提取溶剂分别为30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、50％乙醇、70％乙醇。
[0185]
结果如下表8～9和图15所示。
[0186]
表8保留时间
[0187][0188]
表9峰面积
[0189][0190]
结果表明，采用不同的提取溶剂提取，采用乙醇系统作为溶剂，色谱峰数目有缺失；采用甲醇系统作为提取溶剂，色谱峰数目无明显差异，主要色谱峰均能达到基线分离；采用甲醇、甲醇
‑
水为提取溶剂，14个共有特征峰“总峰面积/称样量”比值随着甲醇浓度升高而增大。
[0191]
(3)供试品制备中提取方式考察
[0192]
按照与“色谱条件与系统适用性试验”相同的条件，以酒女贞子yp
‑
jz(8小时)按照“供试品溶液的制备”项进行供试品的制备，仅改变供试品制备中提取方式进行提取方式考察。考察的提取方式分别为超声提取和回流提取。
[0193]
结果如下表10～11所示。
[0194]
表10保留时间
[0195][0196]
表11峰面积
[0197][0198]
结果表明，回流、超声两种提取方式在色谱峰数目、色谱峰分离效果以及“总峰面积/称样量”方面没有明显差异，考虑操作方便，可选择超声提取。
[0199]
(3)供试品制备中提取溶剂用量考察
[0200]
按照与“色谱条件与系统适用性试验”相同的条件，以酒女贞子yp
‑
jz(8小时)按照“供试品溶液的制备”项进行供试品的制备，仅改变供试品制备中提取溶剂用量。提取溶剂的用量分别为10ml、25ml、50ml、75ml。
[0201]
结果如下表12～13所示。
[0202]
表12保留时间
[0203][0204][0205]
表13峰面积
[0206][0207]
结果表明，采用不同提取溶剂的用量，14个共有特征峰“总峰面积/称样量”比值以加入25ml提取溶剂用量最大，同时考虑到节省溶剂，选择25ml作为提取溶剂的用量。
[0208]
(4)供试品制备中提取时间考察
[0209]
按照与“色谱条件与系统适用性试验”相同的条件，以酒女贞子yp
‑
jz(8小时)按照“供试品溶液的制备”项进行供试品的制备，仅改变供试品制备中提取时间。提取时间分别为30min、45min、60min。
[0210]
结果如下表14～15所示。
[0211]
表14保留时间
[0212][0213]
表15峰面积
[0214][0215]
结果表明，超声提取不同时间，特征图谱色谱峰数目、分离度及特征图谱14个特征峰“总峰面积/称样量”无明显差异，超声30分钟，已经基本提取完全，可适当将超声时间延长至60分钟。
[0216]
实施例2
[0217]
本实施例为女贞子药材及其炮制饮片的指标成分含量检测方法。
[0218]
女贞子含有的三萜类、环烯醚萜苷类及苯乙醇苷类是其主要药效成分，主要代表成分为红景天苷、特女贞苷、女贞苷、女贞苷g13及oleonuezhenide等。本发明以红景天苷、特女贞苷和女贞苷g13为含量测定指标评价女贞子药材及其炮制饮片。
[0219]
1、色谱条件与系统适用性试验
[0220]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(acquity uplc beh shield rp18 column，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；0min～3min，检测波长为284nm，3min～25min，检测波长为224nm。理论板数按特女贞苷峰计算应不低于30000。
[0221]
表1梯度洗脱表
[0222][0223]
2、指标成分对照品溶液的制备
[0224]
取红景天苷对照品、特女贞苷对照品、女贞苷g13对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含200μg的红景天苷对照品溶液，含200μg的特女贞苷对照品溶液，含200μg的女贞苷g13对照品溶液，即得。
[0225]
3、供试品溶液的制备
[0226]
取女贞子药材或其炮制饮片，并制成粉末(过三号筛)，取粉末约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声(功率：500w，频率：40khz)处理60分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0227]
4、测定
[0228]
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪waters h
‑
class，即得。
[0229]
5、测定结果
[0230]
11批女贞子药材及不同炮制时间下酒女贞子饮片含量测定结果如下表16、17：
[0231]
表16 11批女贞子药材含量测定结果(％)
[0232][0233]
表17酒女贞子炮制过程含量测定结果(％)
[0234][0235]
6、方法学验证
[0236]
(1)专属性考察
[0237]
取同一批制备的供试品溶液、指标成分对照品溶液与空白溶剂，在上述液相色谱条件下进行检测，每次进样1μl，记录色谱图。结果如图16所示。结果表明空白溶剂色谱中在与红景天苷、特女贞苷、女贞苷g13相应的保留时间位置上没有色谱峰，表明提取溶剂对红
景天苷、特女贞苷、女贞苷g13的含量测定无干扰，专属性良好。
[0238]
(2)线性关系考察
[0239]
①
红景天苷线性考察
[0240]
精密称取红景天苷对照品置5ml量瓶中，加甲醇分别制成每1ml含红景天苷301.1820μg、红景天苷120.4728μg、红景天苷60.2364μg、红景天苷30.2176μg、红景天苷12.1268μg的系列对照品溶液，在上述液相色谱条件下进行检测，每次进样1μl，以红景天苷浓度为横坐标，以测得的峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，绘制标准曲线，红景天苷的回归方程为：y＝4797.6x
‑
1697.5，其相关系数r2＝0.9996，红景天苷在进样浓度12.1268μg/ml～301.1820μg/ml的范围内，进样浓度与峰面积线性关系良好。结果如图17所示。
[0241]
②
特女贞苷线性考察
[0242]
精密称取特女贞苷对照品置5ml量瓶中，加甲醇分别制成每1ml含特女贞苷247.7600μg、特女贞苷100.1300μg、特女贞苷49.5900μg、特女贞苷24.7000μg、特女贞苷9.8800μg的系列对照品溶液，在上述液相色谱条件下进行检测，每次进样1μl，以特女贞苷浓度为横坐标，以测得的峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，绘制标准曲线，特女贞苷的回归方程为：y＝4794.0x
‑
3785.6，其相关系数r2＝0.9992，特女贞苷在进样浓度9.8800μg/ml～247.7600μg/ml的范围内，进样浓度与峰面积线性关系良好。结果如图18所示。
[0243]
③
女贞苷g13线性考察
[0244]
精密称取女贞苷g13对照品置5ml量瓶中，加甲醇分别制成每1ml含271.1300μg的女贞苷g13、101.0800μg的女贞苷g13、59.2800μg的女贞苷g13、27.1700μg的女贞苷g13、10.8300μg的女贞苷g13的系列对照品溶液，在上述液相色谱条件下进行检测，每次进样1μl，以女贞苷g13浓度为横坐标，以测得的峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，绘制标准曲线，女贞苷g13的回归方程为：y＝3817.2x+25885.8，其相关系数r2＝0.9991，女贞苷g13在进样浓度10.8300μg/ml～271.1300μg/ml的范围内，进样浓度与峰面积线性关系良好。结果如图19所示。
[0245]
(3)精密度试验
[0246]
取同一批样品，在上述液相色谱条件下重复进样6次，每次进样1μl，计算峰面积rsd值。结果显示红景天苷峰面积rsd值为0.60％，特女贞苷峰面积rsd值为0.30％，女贞苷g13峰面积rsd值为0.23％，表明仪器精密度良好。
[0247]
(4)重复性试验
[0248]
取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下进样测定，每次进样1μl。结果显示红景天苷含量均值为0.23％，rsd值为0.62％；特女贞苷含量均值为2.88％，rsd值为0.73％；女贞苷g13含量均值为1.80％，rsd值为0.76％；表明本分析方法重复性良好。
[0249]
(5)准确度试验
[0250]
采用对照品进行加样回收率测定，按格红景天苷对照品、特女贞苷对照品、女贞苷g13对照品加入量与供试品溶液中待测成分红景天苷、特女贞苷、女贞苷g13含量之比为0.5:1，1:1，1.5:1设计3组实验，每组平行3份，分别精密移取适量的红景天苷对照品贮备液、特女贞苷对照品贮备液、女贞苷g13对照品贮备液，在氮吹仪下吹干。取已知含量的取同一批样品约0.15g，精密称定，置3组锥形瓶中，每组平行3份，按供试品制备方法制备供试品
溶液，在上述液相色谱条件下进样测定，每次进样1μl，分别计算准确度，见表18，表19，表20。结果显示红景天苷含量测定分析方法回收率在98.02％～103.02％范围内，rsd为1.51％；特女贞苷含量测定分析方法回收率在96.01％～101.03％范围内，rsd为1.73％；女贞苷g13含量测定分析方法回收率在96.97％～105.75％范围内，rsd为2.78％；符合《中国药典》2020年版9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。
[0251]
表18酒女贞子样品中红景天苷含量测定准确度考察
[0252][0253]
表19酒女贞子样品中特女贞苷含量测定准确度考察
[0254][0255]
表20酒女贞子样品中女贞苷g13含量测定准确度考察
[0256][0257]
(6)稳定性试验
[0258]
取供试品溶液，于室温下放置，在上述液相色谱条件下，分别在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时进行检测，每次进样1μl，记录峰面积，并计算rsd值。结果显示在24小时内进样测定红景天苷峰面积rsd值为4.84％；特女贞苷峰面积rsd值为2.94％；女贞苷g13峰面积rsd值为2.43％，表明24小时内供试品溶液的稳定性较好。
[0259]
同时，还可以将所述女贞子药材及其炮制饮片的uplc图谱分别与实施例1建立得到的女贞子药材及其炮制饮片的特征图谱进行比对，同步获得相应样品女贞子药材及其炮制饮片的特征图谱检测结果和指标成分红景天苷、特女贞苷、女贞苷g13的含量结果，全面进行女贞子药材及其炮制饮片的评价。
[0260]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0261]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。