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一种新型抗菌肽及在柑橘保鲜中的应用的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-01-17 14:23

本发明涉及一种对橘青霉具有抑制作用的抗菌肽ptp的分离及鉴定，主要可以应用于柑橘采后致腐菌橘青霉的抑制及柑橘的采后保鲜。

背景技术：

柑橘是我国南方地区农村经济的支柱产业之一，但是近年来季节性供过于求现象十分突出，加上其储藏期很短，每年都有大量柑橘因橘青霉(penicilliumitalicum)等采后真菌的影响而发生腐败和品质劣变，造成巨大经济损失。化学杀菌剂百可得、咪鲜胺等虽对柑橘的防腐有一定的效果，但处理后的果品品质发生劣变，糖份降低，而且对人体有毒副作用，残留时间长且对环境有污染，许多国家已禁止化学杀菌剂在果蔬采后处理中使用。所以开发出一种绿色健康的生物保鲜剂显得极为紧迫。

草酸青霉(penicilliumoxalicum)是属于半知菌纲(fungiimperficti)壳霉目(sphaeropsidales)杯霉科(discellaceae)中的一大类微生物。其次生代谢产物种类非常丰富。

技术实现要素：

本发明目的之一是提供一种抗菌肽，该抗菌物质为丙二醇甲醚连接的线性4肽化合物thr-thr-val-ser，具体为丙二醇四肽propanedioltetrapeptide，简称ptp，分子式c22h42n4o10，分子量522，结构式如下：

所述的丙二醇甲醚连接的线性4肽化合物中部分肽键及α氨基发生了甲基化。进一步优选为缬氨酸的氨基肽键和苏氨酸的α氨基均发生甲基化。

所述的丙二醇甲醚连接的线性4肽化合物是从草酸青霉sg-4发酵液中分离得到。具体从草酸青霉sg-4发酵液的水相提取物中分离得到。

所述的草酸青霉sg-4是从疏花水柏枝的根中获得的内生真菌，于2015年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccm2015270，分类命名：penicilliumoxalicumsg4，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

本发明的另一技术方案是将丙二醇甲醚连接的线性4肽化合物应用于果蔬生物保鲜上。

进一步优选方案中，所述的抗菌肽在作为柑橘采后致腐菌的抑制剂上的应用。具体是对柑橘采后主要致腐菌橘青霉具有抑制作用的抗菌物质ptp。

本发明的又一技术方案是将所述的抗菌肽在防治农作物真菌性病害上的应用。

本发明所述的抗菌肽用于制备柑橘生物保鲜剂，同时为开发微生物源抗真菌剂提供了新方向。

本发明从草酸青霉sg-4发酵液中分离出一种丙二醇甲醚连接的线性4肽(thr-thr-val-ser，propanedioltetrapeptide，简称ptp)，而且其部分肽键及α氨基发生了甲基化，该类型化合物的结构和功能在国际上还未见相关报道。实验结果表明该物质对橘青霉具有强抑制作用，对柑橘采后的生物保鲜和开发新型抗真菌剂具有重要的意义。

附图说明

图1为粗提物液相分析图。

图2为本发明ptp液相分析图。

图3为本发明ptp高分辨质谱分析图。

图4为本发明ptp13c核磁分析图。

图5为本发明1h核磁分析图。

图6为本发明ptp对橘青霉的拮抗活性比较，其中，a：对照组，b：1mg/ml的百可得作为正对照，c：1mg/ml的sg-4粗提物，d：1mg/ml的ptp，e：1μg/ml的ptp。

图7为水相粗提物柑橘果实的保护作用，其中，a为空白对照，b为接种橘青霉7天后柑橘的腐烂程度，c为涂抹sg-4发酵液水相粗提物并接种橘青霉7天后柑橘的腐烂程度。

图8：粗提物的液相分离及活性分析。

具体实施方式

实施例1

1.主要培养基及分离设备：

pda液(固)体培养基：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、(琼脂20g/l)、ph6.0-6.5、121℃高压灭菌20min后备用。

高效液相色谱型号：岛津lc-16

液相柱型号：ymc-triartc8(250×4.6mml.d.s-5μm,12nm)

2.实验过程：

①菌株活化：

将保藏的sg4原始菌株在pda平板上活化，28℃条件下培养3-5d后，平板上菌落大小合适表型单一、菌丝白色丝状较短、产生大量灰绿色孢子的时候备用。

②发酵培养：

挑取活化平板上的菌块，放入pda液体培养基中，装液量为200ml(500ml锥形瓶)，28℃120r/min条件下培养7d。

③确定sg-4中抑制柑橘致腐菌的活性部位：

通过抽滤将其分为菌体相和发酵液，菌体相用等体积70％丙酮溶液浸提24小时，重复3次后过滤收集滤液，通过旋蒸进行浓缩后冻干保存备用；发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取后，分成水相和酯相两层，分别收集后旋蒸浓缩后，冻干保存，得到水相和酯相的粗提物备用。

④牛津杯法测量抑菌活性大小：

牛津杯法的操作过程(下同)：准备无菌水和洁净的试管(经过121℃，20min高压灭菌)，在试管中加入10ml无菌水，挑取平板上生长状态良好的指示菌菌块(即致腐菌橘青霉和镰刀菌的活化菌块)放入无菌水中，充分摇晃，制备成菌悬液备用。

将pda固体培养基加热融化，制作平板，待平板充分凝固，平皿表面水汽吹干后，在平板表面加入400μl指示菌菌悬液，涂布均匀，将灭过菌的牛津杯竖直立于培养基中心表面，每个牛津杯中滴入200μl合适浓度的样品溶液(粗提物需要过滤)，观察抑菌作用，记录抑菌圈直径。分别利用菌体相、酯相、水相冻干物质进行试验，结果如表1所示，从表1中可以看出活性物质主要存在在水相中。

表1：sg-4提取物的抑菌活性大小

⑤柑橘抑菌及贮藏实验：

将sg-4的水相提取物做了柑橘的抑菌实验，结果发现，空白组柑橘果实接种致病菌橘青霉7天后，全果变软，表皮上形成灰绿色霉层，果皮变为褐色，果实腐烂。实验组柑橘果实涂抹sg-4发酵液水相粗提物并接种橘青霉7天后，仅在伤口周围形成少许白色菌体。由此可证明sg-4发酵液水相粗提物能较好地抑制柑橘致腐菌的生长，阻止柑橘果实的腐烂(图7)。

随后的研究中，进行了柑橘的自然贮藏实验，在用sg-4的发酵液粗提物浸果后，在30天、45天、60天时分别统计柑橘的烂果率和防治效果(表2)，结果表明sg-4水相提取物能有效地防治柑橘的采后病害，提高水果的保鲜程度，保鲜膜对于柑橘预防青霉病等病害并无明显效果，保鲜膜可以有效地阻止柑橘水分的流失，保持其新鲜度。

表2：柑橘自然贮藏实验结果统计

⑥主要活性物质的分离：

将保藏的sg4原始菌株在pda平板上活化，28℃条件下培养3-5d后，平板上菌落大小合适表型单一、菌丝白色丝状较短、产生大量灰绿色孢子的时候备用。挑取活化平板上的菌块，放入pda液体培养基中，装液量为200ml(500ml锥形瓶)，28℃120r/min条件下培养7d。

发酵完成后，进行真空抽滤，弃掉菌丝体，收集发酵液，加入等体积的无水乙醇进行沉淀后，除去无活性的杂质沉淀，将余液进行旋蒸浓缩，粗提物冻干保存备用。将粗提物溶于蒸馏水中，配制成合适浓度的样品液，过滤后进行液相分析制备(波长：210nm；柱温：35℃；进样量：100ul；10％乙腈-100％乙腈变梯度洗脱)，主要活性部位如图8所示。制备不同浓度样品液进行液相分析，根据浓度和目标物峰面积之间的函数关系测算ptp在发酵液中的含量为90mg/l发酵液。

⑦ptp的结构鉴定及活性确定

收集到主要活性物质后，通过高效液相、高分辨质谱、核磁共振等现代波谱分析后，得到物质的结构为丙二醇甲醚连接的线性4肽化合物thr-thr-val-ser(propanedioltetrapeptide，简称ptp)，所述的丙二醇甲醚连接的线性4肽化合物中缬氨酸的氨基肽键和苏氨酸的α氨基均发生甲基化。

该化合物对致腐菌橘青霉的拮抗作用良好，在低浓度1μg/ml时也存在抑菌作用，可以作为一种潜在的抗真菌剂进行开发利用。