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一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法技术

来源：花匠小妙招时间：2025-01-04 06:48

本发明专利技术公开了一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术公开的一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对西瓜ClTDM1进行基因编辑，使该基因功能缺失，从而产生隐性细胞核雄性不育的表型。通过本发明专利技术方法创制的西瓜雄性不育系与正常的材料相比，除了雄花育性发生改变外，其他组织如根、茎、叶、卷须、雌花、果实、种子、生长势等都无可见表型变化。如果将创制的雄性不育新种质用于杂交种子生产将大幅度降低人工成本，提高制种效率，具有重要的生产应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程，更具体的说是涉及一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法。

技术介绍

1、西瓜(citrullus lanatus)，为葫芦科(cucurbitaceae)西瓜属(citrullus)作物。

2、在生产中，西瓜具有明显的杂种优势，而目前传统制种过程中西瓜杂交制种以人工去雄授粉为主，导致制种成本较高且难以保证种子的纯度。目前，雄性不育系已经在水稻、油菜等作物杂交制种上广泛应用。因此，在其他作物中开发新的雄性不育系具有重要的应用价值。

3、植物雄性不育(male sterility)指开花植物在发育中无法产生开裂的花药、有功能的花粉或者有活力的雄配子的生理现象。植物雄性不育系不仅是研究作物杂种优势利用的重要工具，也是研究植物花发育功能的理想材料。目前，已报道的西瓜雄性不育突变体有7个，包括6个隐性核雄性不育和1个显性雄不育突变体。隐性核雄性不育分别命名为：光滑无毛雄性不育突变体(gms)，雄性不育矮生株(ms-dw)，雄性不育系ms-1，ms-2，ms-3，雄性不育两用系se18等。se18突变体材料已完成了雄性不育基因clatm1的克隆和功能验证，其他突变体中雄性不育基因均未开展相关研究，西瓜雄性不育发生的调控机制亦未完全解析。显性雄不育突变体命名为clms1。进一步的研究发现该突变体的表型由clhsp70序列的非同义突变引起，具体的细胞学和分子机理还未被揭示。

4、tdm1(three-division mutant 1)是apc/c亚基结构蛋白。拟南

5、因此，提供一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本专利技术提供了一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法。

2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：

3、通过同源序列比对找到tdm1在西瓜中的同源基因cltdm1。基于该基因，本专利技术利用crispr/cas9技术创制西瓜雄性不育材料，进而应用于西瓜杂交种的生产过程中，将提高制种效率、杂交种纯度，并降低生产成本。

4、一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法，具体步骤如下：

5、(1)根据cltdm1的基因组dna序列分别在cltdm1的外显子1和外显子2上设计靶点，命名为target1和target 2；

6、(2)构建crispr/cas9双靶点敲除载体；

7、①利用限制性内切酶bsai-hf对crispr/cas9载体pbse402进行酶切，回收酶切后的载体pbse402；

8、②以中间载体pcbc-dt1t2为模板，利用引物target1-f/target2-r进行pcr扩增，回收目的片段；

9、③将步骤①酶切后的载体pbse402与步骤②回收的目的片段进行同源重组，转化dh5α感受态；

10、④将步骤③得到的菌落进行鉴定并把条带大小正确的菌落接菌、摇菌、抽提重组质粒进行测序，将测序正确的重组质粒转化至农杆菌eha105感受态中；

11、(3)西瓜遗传转化；

12、经过浸染、共培养、恢复培养、选择培养、芽伸长培养和生根培养阶段得到基因编辑植株并进行表型观察。

13、进一步，所述cltdm1基因组dna序列如seq id no.1所示。

14、进一步，所述靶点target1、target2序列如下：

15、target1序列：5’-tcattcacaaagttcccgc-3’；seq id no.2；

16、target2序列：5’-ataaatgccggggatcgag-3’；seq id no.3。

17、进一步，所述引物target1-f/target2-r序列如下：

18、target1-f：

19、5’-tcgaagtagtgattgtcattcacaaagttcccgcgttttagagc tagaaatagc-3’；seq idno.4；

20、target2-r：

21、5’-ttctagctctaaaacctcgatccccggcatttatcaatctcttag tcgactctac-3’；seq idno.5。

22、进一步，所述的一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法在创制雄性不育西瓜中的应用。

23、进一步，所述方法创制的西瓜雄性不育材料在杂交种子生产中的应用。

24、本专利技术西瓜遗传转化选用的材料为野生品种‘yl’。

25、本专利技术采用crispr/cas9技术创制西瓜雄性不育新种质。通过对cltdm1基因进行基因编辑，使得该基因产生突变从而使蛋白功能缺失，产生雄花无花粉的不育表型。通过本专利技术方法创制的雄性不育材料在生产上的应用，可降低西瓜杂交种生产成本，提高制种效率。

26、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法，该方法首次利用crispr/cas9技术，对cltdm1序列进行基因编辑，使得该基因产生突变，从而产生隐性细胞核雄性不育表型。通过本专利技术方法创制的雄性不育系与正常的材料相比，除了雄花育性发生改变外，其他组织如根、茎、叶、卷须、雌花、果实大小、生长势等都无可见表型变化。如果将创制的雄性不育新种质用于杂交种子生产将大幅度降低人工成本，提高制种效率，具有重要的生产应用潜力。

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【技术保护点】

1.一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法，其特征在于，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法，其特征在于，所述ClTDM1基因组DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法，其特征在于，所述靶点Target1、Target2序列如下：

4.根据权利要求1所述的一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法，其特征在于，所述引物Target1-F/Target2-R序列如下：

5.权利要求1-4任一项所述的一种通过基因编辑ClTDM1创制西瓜雄性不育种质的方法在创制雄性不育西瓜中的应用。

【技术特征摘要】

1.一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法，其特征在于，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法，其特征在于，所述cltdm1基因组dna序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种通过基因编辑cltdm1创制西瓜雄性不育种质的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁黎，刘曼，田树娟，张琪辉，王家发，张显，游兴海，李文鑫，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：