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蒺藜苜蓿MtPAIR1基因、基因编辑载体及其应用制造技术

来源：花匠小妙招时间：2025-01-04 06:48

本发明专利技术公开了蒺藜苜蓿MtPAIR1基因、基因编辑载体及其应用。所述蒺藜苜蓿MtPAIR1基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；本发明专利技术还提供了用于MtPAIR1基因编辑的靶标基因片段、用于编辑MtPAIR1基因的基因编辑载体及其在调控蒺藜苜蓿育性发育或蒺藜苜蓿杂种优势的固定中的应用。本发明专利技术利用基因编辑技术和反向筛选Tnt1突变体库获得苜蓿中控制减数分裂PAIR1基因的突变体，并验证其基因功能是否保守，为创制苜蓿MiMe材料和实现杂种优势固定体系建立奠定基础，为实现苜蓿杂种优势的固定奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从蒺藜苜蓿( medicagotruncatula)中分离的基因及其应用，尤其涉及从蒺藜苜蓿中分离的与育性相关的基因、靶基因片段和基因编辑载体及其应用，属于植物育性基因及其应用领域。

技术介绍

1、植物育性与生殖发育不仅与植物繁衍后代息息相关，也是作物杂种优势利用技术的遗传基础。然而，由于有性生殖过程中遗传信息发生重组使得杂种优势在后代中因发生分离而无法得到保持，因此育种学家以及种子公司必须花费大量的人力、物力以及土地资源进行制种。若能实现农作物杂种优势固定，将大大简化种子选育生产过程，具有重要的经济及社会效益。通过人工创制植物无融合生殖，有望成为实现杂种优势固定的一个可能途径，对于育种者来说提供了非常有用的工具。

2、目前，中国农业科学院水稻研究所王克剑研究员发现在水稻中通过crispr cas9敲除 osmtl基因可以诱导形成单倍体材料，并且同时编辑 osrec8， ospair1， ososd1（三个基因同时突变可使减数分裂转化为类似有丝分裂即mime）和 osmtl（诱导单性结实）四个基因，可以将无融合生殖特性引入杂交水稻中，从而实现杂合基因型的固定（wang, c., etal.clonal seeds from hybrid rice bysimultaneous genome engineering o

3、蒺藜苜蓿( medicagotruncatula)是一年生草本植物，放牧型牧草，因其生长周期短、倍性小、基因组小、自花受粉及固氮等特点，是豆科植物遗传学和基因组学研究的理想模式植物。

技术实现思路

1、本专利技术的目的之一是提供蒺藜苜蓿 mtpair1基因及其编码蛋白；

2、本专利技术的目的之二是提供用于编辑蒺藜苜蓿 mtpair1基因的靶基因片段；

3、本专利技术的目的之三提供将蒺藜苜蓿 mtpair1基因进行功能缺失突变的基因编辑载体；

4、本专利技术的目的之四是将所述的蒺藜苜蓿 mtpair1基因、其靶基因片段或将蒺藜苜蓿 mtpair1基因进行功能缺失突变的基因编辑载体应用于构建 mtpair1基因突变的苜蓿突变体、固定苜蓿杂种优势或创制苜蓿mime材料。

5、为实现上述的目的，本专利技术所采取的主要技术方案包括：

6、本专利技术的再一方面是提供了蒺藜苜蓿 mtpair1基因，其核苷酸序列选自以下(a)-(e)所述的核苷酸序列中的任何一种：

7、(a)seq id no.1所示的多核苷酸序列；

8、(b)编码seq id no.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

9、(c)在严谨杂交条件下能够与（a）或（b）中所述多核苷酸序列进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与调控育性相关；

10、(d)与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有75%或以上同一性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与调控育性相关；优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有85%或以上同一性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与调控育性相关；更优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有90%或以上同一性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与调控育性相关；最优选的，与(a)-(c)任何一种所示的多核苷酸序列至少有95%或以上同一性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与调控育性相关；

11、(e)与(a)-(d)中任何一项所述的多核苷酸序列能够互补的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与调控育性相关。

12、本专利技术中所述的序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers 和miller 算法、needleman-wunsch 全局比对法、smith-waterman 局部比对法、pearson 和lipman 相似性搜索法、karlin 和altschul 的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。

13、另外，本领域技术人员还可以将seq id no.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。

14、本专利技术的另一方面是提供了蒺藜苜蓿 mtpair1基因的编码蛋白（pair1蛋白），其氨基酸序列选自以下(a)-（d）中任何一种所示的氨基酸序列：

15、（a）seq id no.2所示的氨基酸序列；

16、（b）将seq id no.2所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基经过缺失或替换所得到蛋白质变体，该蛋白质变体仍具有调控植物育性的功能或活性；

17、（c）在seq id no.2所示的氨基酸序列中插入一个或多个氨基酸残基所得到蛋白质变体，该蛋白质变体仍具有调控植物育性的功能或活性；

18、（d）与seq id no.2所示的氨基酸序列质具有80％或80％以上同一性的蛋白质，该蛋白质具有调控植物育性的功能或活性。

19、为了使本专利技术提供的pair1蛋白便于纯化或检测，可在该蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上标签，本领域技术人员可以根据纯化或检测的需要，在该蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上相应的标签，这些均是本领域技术人员所习知的技术手段。

20、本专利技术所述的pair1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因再进行生物表达得到。

21、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本专利技术的编码所述pair1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的所述pair1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述pair1蛋白，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。

22、本专利技术中所述pair1蛋白的编码基因可通过将seq id no.1所示的核苷酸序列中缺失一个或几个密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上标签的编码序列所得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.蒺藜苜蓿MtPAIR1基因，其核苷酸序列选自以下(a)或(b)所述的核苷酸序列中的任何一种：

2.权利要求1所述的蒺藜苜蓿MtPAIR1基因的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为

3.用于编辑权利要求1所述蒺藜苜蓿MtPAIR1基因的靶标基因片段，其特征在于，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

4.含有权利要求1所述蒺藜苜蓿MtPAIR1基因的表达盒或重组载体。

5.含有权利要求4所述的表达盒或重组载体的重组宿主细胞。

6.用于编辑权利要求1所述蒺藜苜蓿MtPAIR1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，包括sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，其特征在于，所述sgRNA表达框包含权利要求3所述的靶标基因片段。

7.权利要求1所述的MtPAIR1蒺藜苜蓿基因、权利要求2所述的编码蛋白、权利要求3所述的靶标基因片段或权利要求6所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在调控苜蓿育性发育中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述调控苜蓿育性发

9.一种构建苜蓿MtPAIR1基因功能缺失突变体的方法，包括：

10.权利要求1所述的MtPAIR1蒺藜苜蓿基因、权利要求2所述的编码蛋白、权利要求3所述的靶标基因片段或权利要求6所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体在固定苜蓿杂种优势或创制苜蓿MiMe材料中的应用。