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花生维生素E合成相关基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用

来源：花匠小妙招时间：2024-12-03 20:36

花生维生素E合成相关基因APG1、APG2在提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及花生维生素E合成相关基因APG1、提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用。
【背景技术】
[0002]维生素E是一种脂溶性的小分子抗氧化剂，分为生育酚和生育三烯酚两类，各包括α-、β-、γ-和δ-四种类型，其中以α-生育酚的活性最高，可以被人和动物高效吸收和利用。维生素E具有酚氧基结构，在植物光合组织中可使逆境胁迫产生的活性氧自由基失活，并通过与膜脂水解产物形成复合物，清除类囊体膜上的脂质过氧化产物，阻止膜脂过氧化的扩大，保护膜的完整性，从而增强植株的抗逆境胁迫能力。在非光合组织中，维生素E能淬灭并能同单线态氧反应，保护不饱和脂质免受单线态氧损伤；还可以被超氧阴离子自由基氧化，使不饱和油脂免受自由基攻击，从而抑制油脂的自动氧化，延长油脂的贮存期。另外维生素E还具有调节脂肪酸合成、糖类运输、茉莉酸和乙烯信号转导，促进种子萌发等功能。
[0003]维生素E主要在高等植物的叶绿体内膜上合成，储存于植物的叶片和种子中，尤其是油料植物的种子。维生素E合成的第一步是前体一尿黑酸(HGA)和植基二磷酸(PDP)的合成。第二步是HGA与TOP的缩合，它由尿黑酸植基转移酶(HPT)催化，生成2-甲基-6-植基-1，4-苯醌(MPBQ)。第三步是MPBQ在2-甲基-6-植基-1，4-苯醌甲基转移酶的作用下形成2，3-甲基-5-植基-1，4-苯醌，后者由生育酚环化酶(TC)和γ-生育酚甲基转移酶(γ -ΤΜΤ)催化形成γ -和α -生育酚；MPBQ也可由TC和γ -TMT直接催化形成δ_和0_生育酸。

【发明内容】

[0004]本发明提供了花生维生素E合成相关基因APG1、在提高植物α生育酚含量和耐盐性中的应用，本发明通过将基因转入花生中，可以显著提高转基因植株的维生素E含量和种子的耐盐性。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现:
花生J/^-7基因在提高植物α生育酚含量中的应用，所述花生J/^-2基因的序列表如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
[0006]进一步的，所述花生J/^-7基因能提高植物的α生育酚含量，转J/^-7基因植株叶片中α生育酚含量达到对照的1.74倍；将花生反义载体进行遗传转化后明显减少α生育酚含量，转基因植株叶片中α生育酚含量达对照的20.9%。
[0007]花生基因在提高植物α生育酚含量中的应用，所述花生基因的序列表如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
[0008]进一步的，所述花生基因能提高植物的α生育酚含量，转基因植株叶片中α生育酚含量达到对照的1.34倍；将花生反义载体进行遗传转化后能明显减少α生育酚含量，转基因植株叶片中α生育酚含量达对照的13.7%。
[0009]花生J/^-7基因在提高植物耐盐性中的应用，所述花生J/^-2基因的序列表如SEQID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
[0010]进一步的，所述花生基因受盐胁迫处理的诱导表达，将花生基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率达到36%，同时转基因植株耐盐性增强。
[0011 ] 花生基因在提高植物耐盐性中的应用，所述花生AdC因的序列表如SEQID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
[0012]进一步的，所述花生基因受盐胁迫处理的诱导表达，将花生基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率达到49%，同时转基因植株耐盐性增强。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
1、本发明从花生中克隆了 APG-1和基因(测序结果表明这2个基因均有3个外显子，分别对应 J/^-2和的碱基均为 20-610，1125-1428，2262-2422。
[0014]2、转J/^-7和AdC因花生植株形态发育正常，过量表达APG-1和APG-遵M后，转基因花生叶片中α生育酚含量分别可达到295.4和226.5 Pg/g鲜重，分别为对照(169.6 gg/g鲜重)的1.74和1.34倍；而将花生J/^-2和反义载体进行遗传转化后，转基因植株叶片中α生育酚含量可降低到35.5和23.2 Pg/g鲜重，分别只有对照的20.9%和13.7%。本发明中的可明显改变花生叶片中α生育酚含量(图4)。
[0015]?,,APG-m AdC因均受盐胁迫诱导表达，J/^-2基因受盐胁迫诱导48 h时可达到对照的27.7倍基因受盐胁迫诱导6 h时可达到对照的9倍(图3)。
[0016]4、将花生J/^-7和AdC因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率分别可达到36%和49%，而非转基因种子的发芽率只有15% ;本发明将APG-1和基因在花生过量表达可显著提高种子(图5)和植株(图6)的耐盐性。
[0017]本发明以花生这一重要的油料作物为实验材料，克隆了 2个维生素E生物合成途径中的重要基因APG-1和么并对其功能验证。这将为以后通过基因工程调控花生的α生育酚含量和提高植株的抗逆能力奠定基础。
[0018]结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
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【附图说明】
[0019]图1是本发明中花生的遗传转化，Α:在SM培养基上共培养3 d的子叶外植体；B:在SM+cef培养基上培养2 w的子叶外植体；C:添加100 mg /L卡那霉素的SEM+cef培养基上筛选的抗性芽(培养4 w); D: 150 mg /L卡那霉素的SEM+cef培养基上筛选的抗性苗(培养6 W)。
[0020]图2是本发明中拟转J/^-7和AdC因植株的PCR鉴定，左侧为拟转J/^-7基因阳性苗鉴定DL2000; 1:未转基因植株(对照)；2-8:拟转基因植株；右侧为拟转
基因阳性苗鉴定:M: DL2000; 1:未转基因植株(对照)；2-8:拟转基因植株图3是本发明中1.5% NaCl胁迫处理后APG-1和AdC因在不同时间段的相对表达量。
[0021 ] 图4是本发明中对照花育23号和T2代转基因花生种子在0.7%的NaCl溶液中的发芽情况；a:花育23号种子；b:过量表达J/^-2基因的T2代花生种子；c:过量表达基因的T2代花生种子。
[0022]图5是本发明中对照花育23号和T2R转基因植株经1.5%的NaCl溶液胁迫处理7天后的情况；左:花育23号种子；中:过量表达J/^-2基因的T2代花生植株；右:过量表达AdC因的τ 2代花生植株。
[0023]图6是本发明中用高效液相色谱测定对照花育23号和1~2代转基因植株叶片的生育酚含量，图6a:花育23号叶片的生育酚含量；图6b:过量表达J/^-2基因的T2代花生叶片的生育酚含量；图6c:过量表达基因的T2代花生叶片的生育酚含量；图6d:转化反义基因的1~2代花生叶片的生育酚含量果；图6e:转化反义基因的1~2代花生叶片的生育酚含量。
[0024]图7是本发明中过量表达APGl基因T2代种子的品种性状。
[0025]图8是本发明中过量表达基因T 2代种子的品种性状。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案作进一步详细的说明。
[0027]实施例1:花生维生素E合成相关基因APG1、APG2 一、实验材料
1.基因、菌种与花生品种
本发明克隆了花生2个基因(AAAU和，大肠杆菌DH5 α由青岛农业大学遗传研宄室实验室保存，根癌农杆菌菌株ΕΗΑ105 (购自北京天恩泽基因科技有限公司)，转基因的受体材料为花生品种“花育23号”(由山东农科院花生所育成，青岛农业大学遗传研宄室实验室引进)。
[0028]2.植物培养基花生转化中采用的培养基有:
基本培养基:为MS无机盐+85有机成分(简称MSB5)，添加3%蔗糖、0.8%琼脂，ρΗ=5.8，在121。。、105 Kpa条件下灭菌20min ;
SM 诱导培养基:MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2，4_D ；
SEM芽伸长培养基:MSB5+5 mg/L BAP。
[0029]cef:头孢霉素。
[0030]二、实验方法
本发明包括以下具体实验步骤:
1、扩增获得基因全序列
花生J/^-7基因，其序列表如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No: 2所示。
[0031]花生基因，其序列表如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列表如SEQ ID No:4所示。
[0032]克隆所述花生J/^-7和基因的引物名称与序列如下:Pl:5 ; - TCAGGTTCCTTCTTCAACAATGGCT -3 ; (SEQ ID No:7);
P2:5 ; - ACGGCTCTTAGATTGGCTGACCCT -3 ; (SEQ ID No:8);
分别与基因第1-25碱基、第2406-2429碱基对应；与AdC因第1_25碱基、第2406-2429碱基对应。
[0033]2、基因植物表达载体的构建
(I)扩增义^基因编码区
花生品种“花育23号”由青岛农业大学遗传研宄室实验室引进，通过RT-PCR扩增了基因的编码区(APG1编码区序列表如SEQ ID No:5所示，APG2编码区序列表如SEQ IDNo:6所示)。
[0034]P3:5 ' - GGTACCTCAGGTTCCTTCTTCAACAATGGCT ~3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:9);
Ρ4:5 ' - GGTACCACGGCTCTTAGATTGGCTGACCCT -3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:10)；
上述引物序列除去酶切接头外分别与基因的第1-25碱基、第1059-1082碱基对应；与基因的第1-25碱基、第1059-1082碱基对应。
[0035](2) 基因与克隆载体pUC18及植物表达载体pBI121的连接
回收PCR产物，并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18 (购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，测序后获得2种不同的DNA片段，分别命名为和AhAPG-2a用Kpnl进行酶切，回收含AhAPGim基因的酶切片段，分别正向克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI和PBI121- AMPG2'反向克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的反义表达载体:反义和反义^H2l-AhAPG20
[0036]3、将上述表达载体转化花生，包括以下步骤:
a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备:分别将