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DNA纳米花、其制备方法以及在靶向治疗肝脏肿瘤细胞中的用途

来源：花匠小妙招时间：2024-12-03 20:10

DNA

本发明属于生物医药，尤其涉及到一种dna纳米花、其制备方法以及在靶向治疗肝脏肿瘤细胞中的用途。

背景技术：

1、治疗肝癌的方法主要包括化学药物治疗、放射治疗和手术治疗等方法。化学药物治疗是全身性系统给药，药物在杀死肿瘤细胞的同时，也会伤害正常组织细胞，甚至出现严重的毒副作用，放疗也是如此。通常情况下，化疗和放疗都可用作肿瘤手术的辅助治疗，该治疗方式普适性强，是目前最有效的肿瘤治疗方式之一。

2、许多多种功能纳米材料已用于癌症的早期诊断与有效治疗，如复合纳米材料、核酸纳米结构、脂质纳米材料和聚合物纳米结构等。dna纳米结构技术自上世纪八十年代提出，dna是生物系统中储存和传递遗传信息的分子。而dna纳米结构技术领域正是将这种分子从其生物学背景中分离出来，利用其序列信息来组装纳米结构，然后将它们连接起来。dna可以用自动化方法进行快速合成和修饰，且可以利用多种dna作用酶进一步调整和修饰它的结构。因此，dna结构是最理想的纳米结构材料。

3、核酸适配体是通过“指数富集的配体系统进化”技术筛选出来的一类单链寡核苷酸，其能够通过分子内杂交形成特定的结构，如茎环结构、四链体结构等，进而与蛋白质、小分子化合物以及肿瘤细胞特异性结合。

4、glypican-3(gpc3)是一种硫酸乙酰肝素蛋白多糖，属于哺乳动物糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定的细胞表面glypican蛋白家族。肝细胞癌遗传分析显示，大多数病例与gpc3上调有关，gpc3染色阳性可预测肝细胞癌患者的临床预后较差，且gpc3在正常肝组织中几乎不表达，即gpc3是肝细胞癌精准诊断和治疗的重要靶点。然而，现有技术中还未有利用glypican-3作为靶点的dna纳米结构技术对肝癌肿瘤细胞进行靶向治疗的报道。

技术实现思路

1、本发明提供了一种dna纳米花、其制备方法以及在靶向治疗肝癌中的用途，所提供的dna纳米花生物安全性高、结构稳定性好、尺寸为纳米级别，可精准靶向肝癌肿瘤细胞，促进肿瘤细胞的凋亡。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种dna纳米花材料，通过以下方法制备得到：

3、以包含有gpc3核酸适配体靶向序列的互补磷酸化模板序列为dna模板链，在类芬顿试剂铜离子cu2+的介导下进行滚环扩增(rca)，同时将葡萄糖氧化酶gox封装于其内，得到含有cu2+和葡萄糖氧化酶gox的dna纳米花；

4、将上述含有cu2+和葡萄糖氧化酶gox的dna纳米花与阿霉素dox共孵育，得到共负载的dna纳米花材料apt-goxcu@dox-nfs。

5、在上述方案中，利用滚环扩增技术(rca)合成了一种新型dna纳米花材料，其通过在类芬顿试剂铜离子cu2+的介导下进行滚环扩增(rca)，然后rca过程中产生的焦磷酸根离子(ppi4-)与mg2+形成焦磷酸镁沉淀(mg2ppi)，在长链dna的驱动下进一步成核和生长，最终形成三维花状结构；同时将葡萄糖氧化酶gox封装于其内，实现了葡萄糖氧化酶(gox)、类芬顿试剂铜离子(cu2+)、化疗药物阿霉素(dox)的共负载，得到的apt-goxcu@dox-nfs能特异性识别gpc3阳性的肿瘤细胞，进而通过细胞内吞进入溶酶体后逃逸裂解释放的途径进入细胞并完成药物释放。

6、如图1进入肿瘤细胞发挥杀伤作用的多模态途径所示，在溶酶体的酸性ph值环境下，dna纳米花开始发生裂解，并将负载的药物释放。纳米花中的葡萄糖氧化酶gox能够氧化细胞内部葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，以此来消耗肿瘤微环境的氧气和葡萄糖，使肿瘤细胞生长需要的营养物质减少，达成饥饿治疗的效果，此步骤产生的葡萄糖酸也会继续降低环境中的ph值，促进药物释放。同时，材料中的cu2+被细胞内高浓度的谷胱甘肽(gsh)还原为类芬顿试剂cu+，cu+与饥饿治疗中的产物过氧化氢发生类芬顿反应，生成活性氧-羟基自由基，活性氧的产生对肿瘤细胞有化学动力学的治疗。纳米花充分裂解后，封装的dox也得到释放并发挥化疗作用，最终实现对gpc3阳性的肝脏肿瘤的饥饿治疗/化学动力学治疗/化疗三模态协同治疗。

7、作为优选，所述dna模板链的序列如seq id no:1所示。

8、作为优选，所述dna模板链包括ap631-1的核酸适体互补序列和dox载药互补序列。

9、作为优选，所述ap631-1的核酸适体互补序列如seq id no:2所示，所述dox载药互补序列如seq id no:3所示。

10、作为优选，得到含有cu2+和葡萄糖氧化酶gox的dna纳米花具体为：

11、将dna模板链和引物以体积比1：2在pbs或水溶液中混合，得到混合物；

12、将所得混合物在终体积为20μl的t4 dna连接酶缓冲液中95℃加热5分钟，然后在3h之内使用pcr热反应器逐渐冷却至室温，以完成退火；

13、向退火后的dna模板链的反应液中加入t4 dna连接酶于16-20℃下过夜；

14、将反应液加热至65℃维持10分钟，形成闭合的dna环模板；

15、将所得闭合的dna环模板3μl与phi29 dna聚合酶2μl、phi29 dna聚合酶缓冲液5μl、dntps 5μl和葡萄糖氧化酶gox 2.5μl混合在缓冲液中，于30℃反应1h，dna中焦磷酸根离子(ppi4-)与反应体系中mg2+形成焦磷酸镁沉淀(mg2ppi)，形成dna纳米花；其中，聚合酶缓冲液包括：500mm tris-hcl(ph7.5，25℃下)、100mm mgcl2、100mm(nh4)2so4、40mm dtt；

16、将上述所得产物与cu2+混合，于25-30℃继续孵育反应12小时，聚合反应结束后，于65℃下反应10分钟对聚合酶灭活，终止后得到含有cu2+和葡萄糖氧化酶gox的dna纳米花。

17、作为优选，所述引物的序列如seq id no:4所示。

18、作为优选，与阿霉素dox共孵育的温度为16-20℃，dox与纳米花的体积比为2:1，时间为16h-24h。

19、本发明还提供了一种根据上述任一项技术方案所述的dna纳米花材料apt-goxcu@dox-nfs在制备特异性识别gpc3阳性的肝脏肿瘤细胞的药物中的应用。

20、本发明还提供了一种根据上述任一项技术方案所述的dna纳米花材料apt-goxcu@dox-nfs在制备靶向治疗肝脏肿瘤的药物中的应用。

21、本发明还提供了一种以肝脏肿瘤的饥饿治疗/化学动力学治疗/化疗三模态协同治疗的模型，通过将上述任一项技术方案所述的dna纳米花材料apt-goxcu@dox-nfs应用于肝脏肿瘤的治疗中，使其精准与gpc3高表达的肝脏肿瘤细胞结合并发生内吞，完成靶向和精准释放药物。

22、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

23、1、本发明提供的dna纳米花解决了靶标位点的选择和靶向，选择了只在肝脏肿瘤细胞中特异性表达的gpc3靶标蛋白，并通过引入功能核酸分子-核酸适配体，通过其靶标预实验确定了通过核酸适体的扩增来达到靶标肿瘤细胞的目的。

24、2、本发明利用dna纳米药物合成原理，达到使得有效序列可以稳定扩增并发挥作用，解决了效率低的问题。具体的，在rca过程中产生的焦磷酸根离子(ppi4-)与mg2+形成焦磷酸镁沉淀(mg2ppi)，在长链dna的驱动下进一步成核和生长，最终形成三维花状结构。与基于碱基互补作用构建的dna纳米材料不同，基于rca构建的dna纳米花主要依赖于长链dna的液晶化和密堆积，无需对dna序列进行复杂设计，故其操作简单、成本低廉。

25、3、本发明在合成纳米花时还引入了cu2+和生物分子葡萄糖氧化酶，二价金属离子是dna形成三维花瓣褶皱的必备条件，除了本身缓冲液中的mg2+，加入的cu2+都可以使得纳米花结果更紧密和稳定，解决了药物结构不稳定的问题。此外，加入的生物分子葡萄糖氧化酶不仅可以消耗葡萄糖达到饥饿治疗的目的，还可以级联cu2+达到化学动力学治疗的目的，再联合dox的化疗作用，即可以形成多模态联合治疗肿瘤的模型，解决了单一治疗效果差的问题，进一步在靶向治疗的基础上高效杀伤肿瘤细胞。

26、4、本发明提供的dna纳米花解决了药物对正常细胞的损伤问题，可完成可控释放药物，实验证明在pbs和血液中药物稳定性高，到达肿瘤微环境后。首先是被肿瘤细胞内吞进入溶酶体，酸性条件下该纳米花会开始发生裂解，ph值5.5是dna纳米花的裂解最适ph，就完成了在肿瘤细胞内部裂解释放药物，促进肿瘤细胞凋亡。