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一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法技术

来源：花匠小妙招时间：2024-11-30 21:19

本发明专利技术提供一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法，包括以下步骤：步骤一、制备CRISPR‑Cas质粒文库；步骤二、将步骤一中制备的CRISPR‑Cas质粒文库转化农杆菌后，涂布于含有抗生素的固体培养基上，培养至长出大量农杆菌菌落；步骤三、将步骤二中的得到的部分或者全部农杆菌菌落刮落重悬后，转化植物外植体，实现对植物的大规模基因组编辑。进一步地，重悬后，不经扩大培养直接转化植物外植体，实现一个转化事件产生一种基因组编辑的效果。本发明专利技术能在植物上实现大规模、高通量的基因组编辑，与传统方法相比，基因编辑植株的效率和通量获得大幅提升，从而可提供大量的种质资源，服务于育种。

A method of large-scale genome editing for plants

The present invention provides a method for large-scale genome editing plant, which comprises the following steps: first, the preparation of CRISPR Cas plasmid library; step two, step a prepared CRISPR Cas plasmid library of Agrobacterium tumefaciens, coated on solid medium containing antibiotics and cultured to grow a large number of Agrobacterium colonies; step three, will be part of the second step or all scrapings resuspended Agrobacterium colonies after transformation of plant explants, large-scale genome editing of plants. Further, the plant explants were transformed directly without expanded culture to achieve a transformation event, resulting in a genomic editing effect. The invention can realize large-scale and high-throughput genome editing on plants. Compared with traditional methods, the efficiency and flux of gene editing plants are greatly improved, so as to provide a large amount of germplasm resources and serve for breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法
本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法。
技术介绍
锌指核酸技术(Zincfingernuclease,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases,Talen)和CRISPR-Cas技术(Cong,L.,etal.,MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science,2013.339(6121):p.819-23)是这几年基因组编辑领域的几项突破性技术。这三种技术都可以在生物体基因组指定位点特异性的切割DNA产生双链断裂，从而利用生物的非同源末端连接或同源重组，进行定点编辑。ZFN和Talen技术用特异性的蛋白引导，蛋白元件的构建相对较复杂，编辑效率有待提高。CRISPR-Cas技术以RNA引导，体外构建简单，编辑效率较高。CRISPR的全称是短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)。Cas基因的全称是CRISPR关联基因(CRISPRassociated)，存在于CRISPR位点附近。Cas基因编码的蛋白质主要是双链DNA核酸酶，含有两个酶切活性位点，每个位点负责剪切靶基因DNA双螺旋中的一条单链。能在向导RNA(guideRNA)的引导下对靶位点进行切割。目前发现的Cas包括Cas1～10等多种类型。目前，这三种技术已成功的应用于多种生...

【技术保护点】
一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备CRISPR‑Cas质粒文库；步骤二、将所述步骤一中制备的CRISPR‑Cas质粒文库转化农杆菌后，涂布于含有抗生素的固体培养基上，培养至长出大量农杆菌菌落；步骤三、将所述步骤二中的得到的部分或者全部农杆菌菌落刮落重悬后，转化植物外植体，实现对植物的大规模基因组编辑。

【技术特征摘要】
1.一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备CRISPR-Cas质粒文库；步骤二、将所述步骤一中制备的CRISPR-Cas质粒文库转化农杆菌后，涂布于含有抗生素的固体培养基上，培养至长出大量农杆菌菌落；步骤三、将所述步骤二中的得到的部分或者全部农杆菌菌落刮落重悬后，转化植物外植体，实现对植物的大规模基因组编辑。2.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤一中采用适用于农杆菌转化的双元载体作为质粒载体；所述双元载体包含CRISPR-Cas所需的sgRNA表达框。3.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas质粒文库中每个质粒表达一个或多个sgRNA。4.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas质粒文库为CRISPR-Cas9质粒文库；所述CRISPR-Cas质粒文库为用于基因敲除、基因组片段敲除和/或基因激活的质粒文库。5.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤一包括：步骤1.1、对植物基因组进行分析，在全基因组范围内根据DNA序列特异性、GC含量和位置效应对每个基因选择2-3个靶点作为sgRNA，所述sgRNA长度为17-21bp，避免sgRNA的二级结构和Poly(T)结构；步骤1.2、合成所述步骤1.1中的sgRNA，并分别在其两端加...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱扬文，
申请(专利权)人：百格基因科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32