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植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展

来源：花匠小妙招时间：2024-11-20 14:14

1、遗传 hereditas (beijing) 2015 年 10 月，37(10): 953973?194-2015 china academic jcumal ekctronic ?(hishing hi)use. all rights reserved, http:高彩霞课题组主要从事重要农作物基因组定向编辑技术方法的研究与应用、农作物遗传转化技术体系的建立与应用，以及小麦、玉米、水稻等重要基因的功能解析及基因组编辑定向设计分子育种研究。他们率先利用crispr/cas系统实现水稻和小麦的基因组编辑，并利用该技术首创抗白粉病小麦新材料和改

2、良水稻的香味品质，近期他们将该crispr切割系统引入植物，在植物中建立了 dna病毒防御体系。相关成果以通讯作者身份发表在nature biotechnology、natureplants、nature protocols 、plos biology、molecular plant 、plant biotechnology journal 和 journal of genomics and genetics 等期干u上。植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展单奇伟，高彩霞中国科学院遗传与发育生物学研究所，植物细胞与染色体工程国家重点实验室，北京100101摘要：基因组编辑技术已经在多个模式植物

3、、动物以及其他生物中得到成功应用。基因组编辑是利用序列特异核酸酶(sequence-specific nucleases, ssns)在基因组特定位点产生dna 双链断裂(double-strand breaks, dsbs),从而激活细胞自身修复机制非同源末端连接(non-homologous end joining, nhej)或同源重组(homologousrecombination, hr),实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换等。锌指核酸酶(zinc finger nuclease,zfn)、talen(transcription activator-like effect

4、or nuclease) 和 crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated 9)系统是最主要的 3 类 ssns。zfn 和 talen 是利用蛋白与 dna 结合方式靶向特定的基因组位点，而最新的cirispr/cas9系统则是利用更简单的核音酸互补配对方式结合在基因组靶位点，其构建简单、效率更高效，因而促进了基因组编辑在植物中的广泛应用。利用基因组编辑技术除了实现植物基因定点突变外，还可以将ssns的dna结合域与其他功能蛋白融合，实现基因的靶向激活、抑制和

5、表观调控等衍生技术。本文从基因组编辑技术的原理与优势、ssns组成及构建方法、基因组编辑及衍生技术在植物中应用、优化ssns突变效率和减少脱靶突变方法等方面进行了系统介绍，并对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望。关键词：基因组编辑；zfn ; talen ; crispr/cas9 ;同源重组；脱靶突变research progress of genome editing and derivative technologies in plantsqiwei shan, caixia gaostate key laboratory of plant cell and chromosome

6、 engineering, institute of genetics and developmental biology, chinese academy of sciences, beijing 100101, chinaabstract:genome editing technologies using engineered nucleases have been widely used in many model organisms. genome editing with sequence-specific nuclease (ssn) creates dna double-stra

7、nd breaks (dsbs) in the genomic target sites that are primarily repaired by the non-homologous end joining (nhej) or homologous recombi-收稿日期:2015-04-13;修回日期:2015-06-18基金项目：国家自然科学基金项目(编号：31420103912和31271795)和转基因重大专项(编号：2014zx0801003b)资助作者简介：单奇伟，博士，研究方向：遗传学。 e-mail: 通讯作者：高彩霞，博士，研究员，博士

8、生导师，研究方向：遗传学。e-mail: doi: 10.16288/j.yczz.15-156网络出版时间:2015-9-1 11:14:07url: /kcms/detail/11.1913.r20150901.1114.006.html第10期单奇伟等：植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展957nation (hr) pathways, which can be employed to achieve targeted genome modifications such as gene mutations, ins

9、ertions, replacements or chromosome rearrangements. there are three major ssns zinc finger nuclease (zfn), transcription activator-like effector nuclease (talen) and clustered regularly interspaced short palindromic re- peats/crispr-associated 9 (crispr/cas9) system. in contrast to zfn and talen, wh

10、ich require substantial protein engineering to each dna target, the crispr/cas9 system requires only a change in the guide rna. for this reason, the crispr/cas9 system is a simple, inexpensive and versatile tool for genome engineering. furthermore, a modified version of the crispr/cas9 system has be

11、en developed to recruit heterologous domains that can regulate endogenous gene expression, such as activation, depression and epigenetic regulation. in this review, we summarize the development and applications of genome editing technologies for basic research and biotechnology, as well as highlight

12、 challenges and future directions, with particular emphasis on plants.keywords:genome editing; zfn; talen; crispr/cas9; homologous recombination; off-target mutation?115 china academ)3,5,随着生命科学研究进入基因组时代，越来越多物种的基因组完成测序，解读与改造基因组的功能就显得非常紧迫。以基因组编辑(genome editing)为基础的反向遗传学技术是基因组改造与基因功能研究必不可少的手段之一 1。基因

13、组编辑技术是一项可以与分子克隆、pcr等技术相媲美的技术突破，虽然出现仅仅10余年，但已显著地促进了生物学研究的迅猛发展，应用前景广阔。以序列特异核酸酶 (sequence-specific nucleases, ssns)为工具的基因组编辑技术已在全世界掀起了研究热潮。2012年 science将其列入年度10大科学进展，以talen为代表的ssns被誉为“基因组巡航导弹”。2013年science再次将ssns技术的新星crispr/cas9列入年度十大科学进展。2014年nature methods将基因组编辑技术评为过去10年间对生物学研究最有影响力的10项研究方法之一。1

14、基因组编辑技术的原理及优势1.1 基因组编辑技术的原理及dna断裂修复机制近几年，生物学家们巧妙地利用蛋白质结构与功能领域的研究成果，将特异识别与结合 dna的蛋白质结构域和核酸内切酶结构域融合，创造出能够按照人们意愿特异切割dna的ssns,并藉此实现了对基因组特定位点的靶向彳饰，即基因组编辑。ssns 主要包括3种类型：锌指核酸酶(zinc finger nuclease, zfn)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease, talen)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clustered

15、 regularly interspaced short palindromic repeats/crispr- associated 9, crispr/cas9 system)(图 1, ac)。它们的共同特征是能够作为核酸内切酶切割特定的 dna 序列，创造 dna 双链断裂(double-strand breaks, dsbs)。在真核生物中，dsbs的修复机制是高度保守的，主要包括两种途径：非同源末端连接 (non- homologous end joining, nhej) 和同源重组(homologous recombination, hr)。通过 nhej 方式，断裂的染色

16、体会重新连接，但往往是不精确的，断裂位置会产生少量核甘酸的插入或删除，从而产生基因敲除突变体；通过 hr方式，在引入同源序列的情况下，以同源序列为模板进行合成修复，从而产生精确的定点替换或者插入突变体2(图2)。在这两种途径中，nhej方式占绝对主导，可以发生在几乎所有类型的细胞以及不同的细胞周期中(gi、s和g2期)；然而，hr发生频率很低，主要发生在s和g2期网。fm1b taletale图1 3种序列特异核酸酶(ssns)模式图a ：锌指核酸酶； b: tale核酸酶； c： crispras9系统acnhejbanhej定点突变定点删除iir dma模板定点插入或捍换图2

17、dna 双链断裂（dsbs）修复途径序列特异核酸酶（ssns）可以在基因组特定位点制造dna双链断裂，通过 nhej途径修复实现定点突变（左）；在同一条染色体上制造两个 dsbs ,通过 nhej途径修复实现定点删除（中）；在提供供体dna模板时，可以通过 hr途径精确修复，实现定点插入或定点替换（右）。1.1.1 nhej 途径根据具体修复方式和参与修复的蛋白因子，可以将 nhej 分为两类：一类是 classical nhej （cnhej）; 另一类是 alternative nhej （anhej） 4。这两种机制在所有真核生物中是高度保守的。通过cnhej途径， ssn诱

18、导的dsbs末端首先被具有环状结构的ku蛋白异源二聚体（ku70、ku80）结合以防止 dna断裂末端进一步降解，最后在特定的dna连接酶iv的作用下，将两个开放的末端重新连接（图3a）。在连接前可能经过末端加工过程，因而产生几个核甘酸的插入或删除（indel）,但多数情况下不经过加工过程而直接恢复为原始序列。从基因组编辑的角度看，经过末端加工产生少量核甘酸插入或删除是更有意义的。如果dsbs发生在编码基因的 orf区，插入或删除非3整数倍的核甘酸，可能造成移码突变使基因功能完全丧失。如果cnhej途径被制或 dsbs两侧含有几个或十几个核甘酸的微同源序列，则可能通过anhe

19、j途径修复。研究表明，dsbs末端分别发生5至3 方向的dna切除，释放出可局部互补配对的单链末端，微同源序列互补配对，再经过末端处理和重新连接修复dsbs缺口。修复后微同源序列恰好位于 dsbs的结合点。由于发生了核甘酸的删除，造成遗传信息丢失，因此在基因组编辑过程中anhej修复方式很容易产生突变（图3b）。研究表明，这两种 nhej途径在细胞中会相互竞争。与野生型相比，拟南芥ku80突变体indel突变效率增加2.6倍，并且 dsbs位置核甘酸降解长度也有所增加5。图3两种非同源末端连接（nhej）修复途径方式（参考文献3修改绘制）a : cnhej ; b : anhej。

20、1.1.2 hr 途径根据发生方式的不同，hr可以分为两类：单链退火（single-strand annealing, ssa）和合成依赖式链退火（synthesis-dependent strand annealing, sdsa）。 dsbs产生后，在这两种途径下dna断裂末端都会发生5至3方向的dna切除，形成3单链末端。ssa 途径类似anhej途径，dsbs两端各有一段同源序列，同源序列区域直接退火形成互补双链，再经过末端加工和连接修复 dsbs（图4a）。在基因组串联重复区域，ssa是主要的dsbs修复方式6。sdsa途径是依赖dna合成的修复过程，基因组编辑过程中同源重

21、组通常是指这种方式。dsb经过5至3方向的dna切除产生的一个3单链末端入侵同源供体dna模板，形成d-loop环状结构，再利用同源dna的互补链作为模板进行 dna合成修复，当延伸至可以与dsb另一个单链末端互补配对assabsdsa图4 两种同源重组（hr）修复途径方式（参考文献3修改绘制）a : ssa; b: sdsa 。第10期单奇伟等：植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展959位置时，脱离 d-loop结构，两个单链 dsb末端退火形成双链，完成修复过程 (图4b)。sdsa途径最终结果就是完成从同源 dna至dsb遗传信息的转换过程。sdsa途径发生频率非常低，相同

22、条件下只有ssa方式的10%20%7。1.2 基因组编辑技术优势当前遗传改良或基因修饰途径存在许多缺陷。例如：传统杂交育种法周期长，需要多个世代，耗时费力，且受物种间生殖隔离限制和不良基因连锁的影响；物理或化学诱变法虽然可以在基因组上随机产生大量突变位点，但突变位点鉴定十分困难；传统基因打靶方法效率极低(通常仅10-610-5),并且只限于少数物种如酵母 (saccharomyces cerevisiae)、小鼠(mus musculus)等；rnai方法下调基因表达不够彻底，其后代的基因沉默效果减弱甚至完全消失，不能稳定遗传。相比于上述方法，基因组编辑技术优势非常明显：

23、(1)所有ssns都可以通过设计 dna 结合蛋白(或导向rna)使其靶向编辑基因组的任意位点，精确性非常高；(2)原理简单易懂，而且技术操作简便、成本相对低廉，原则上适用于任意物种；利用ssns定点突变目的基因具有非常高的效率，通常从几个或十几个转化株系中就能筛选到符合要求的基因突变材料，对于活性高的ssns在to代就可以得到纯合突变体。目前，基因组编辑技术已成功应用于酵母、线虫(caenorhabditis elegans)、果蝇 (drosophila melanogaster / 斑马鱼(danio rerio 卜小鼠、人类(homo sapiens)细胞、拟南芥(ara

24、bidopsis thaliana)、烟草(nicotiana tabacum 卜大豆(glycine max)、水稻(oryza sativa)、小麦(triticum aestivum )、大麦(hordeum vulgare)和玉米(zea mays)等多种模式生物及经济作物中8。2 ssns组成及构建方法2.1 zfns组成及构建方法zfns是通过基因工程方法将锌指蛋白dna结合域(zfa)和核酸内切酶fok i的切割结构域融合而成，dna结合域通常由36个cys2his2类型的锌指单元串联而成9。每个锌指单元含有1个“螺旋和2个3折叠结构，并且螯合 1个锌原子。1个锌指单元

25、能特异识别 dna单链上3个连续的核甘酸；由多个锌指单元串联形成的zfa结构域则可识别更长的靶序列，同时增加了 dna靶向修饰的特异性。当两个zfn单体按照一定的距离和方向同各自的目标位点特异结合，两个 fok i切割结构域恰好可形成二聚体的活性形式，在两个结合位点的间隔区 (spacer,通常为 57 bp)切割 dna (图 1a)。理论上每个锌指单元识别3个核甘酸，1个包含64个锌指的文库就可以识别所有的串联三联体核甘酸。在应用中发现单个锌指的识别特性在不同的串联锌指单元zfa中差异非常大，是由于相邻锌指造成的上下文背景起了重要影响。当前主要有4种设计方案，包括：模块组装方

26、案(modular assembly , ma)10、基于文库筛选的open方案11、sangamo公司私有的双锌指模块组装方案(two-finger modules) 12 和上下文依赖组装方案(coda) 13。 ma方案虽然简便，但完全不考虑上下文背景作用，其成功率最低。另外3种方案都考虑了上下文的背景影响。当前有几种程序可以辅助设计zfn靶位点，具体见表1。2.2 talen 组成及构建方法类转录激活因子效应物(transcription activator-like effector, tale)是黄单胞杆菌属(xanthomona 植物病原菌通过m型分泌系统分泌到宿主细胞中

27、的一种毒性蛋白，可以识别植物特定基因启动子序列，启动感病基因表达。tale核酸酶(talens)就是利用tale的dna结合域和fok i的切割结构域合成的人工核酸酶14(图1b)。tale的dna结合域包含 1个由数量不等的重复单元串联组成的重复序列结构，这些重复单元通常由3335个高度保守的氨基酸组成，第12和13位氨基酸可变，被称为重复可变双残基(repeat variable diresidue, rvd)。每个 rvd 与核甘酸a、t、c、g存在简单对应的关系，即 ni 识另ia、hd识另1j c、ng识另1j t和nn识另g15,16。 tale蛋白以这种个重复单位一

28、个核甘酸 ”的对应方式特异识别并结合dna。2012年，tale蛋白晶体结构被解析出来，结构显示tale的重复单元组成helix-loop-helix 的结构围绕 dna双螺旋主沟呈右手螺旋状排列，结构还显示rvd的两个残基中第一位氨基酸稳定 rvd loop作用，第二位氨基酸与碱基特异识别相关17,18 ,这些信息为改造 tale蛋?1994-2015 chiraumal e outran it publisshing hu us* all rights reserved, http iw w w htjnk i ttiil表1 ssns资源及在线程序程序名称zifi targeter

29、 software设计 zfn/zfa/zifitzinc-finger tools设计 zfn/zfa/barbas/zfdesign/zfdesignhome.phpthe segal lab software site设计 zfn/zfa:8080/plonethe zfn-site搜索脱靶位点ccg.vital-it.ch/tagger/targetsearch.htmle-talen设计talen/e-talen/mojo hand

30、设计talen/talen design tool设计talen/wordpress/tal effector nucleotide targeter 2.0设计 talen/tale/zifit targeter software设计 talen/tale/zifit/genome engineering resources设计tale及其他资源/eendb人工核酸酶数据库eendb

31、./index.phpscoring algorithm for predicting talen activity (sapta)预测tale(n)活性/research/bioinformatictools/tal_targeter.htmltal plasmids sequence assembly tool生成tale质粒全长序列/research/bioinformatictools/assembletalseq- uences.htmlprognos tool搜索tale

32、n 和zfn脱靶位点/research/bioinformatictools/prognos.htmltalenoffer搜索talen脱靶位点rmatik.uni-halle.de:8976/e-pcr搜索脱靶位点/tools/epcr/e-crisp设计crispr/e-crisp/sgrna designer设计crispr/rnai/public/analysis-tools/sgrna-designcris

33、prtarget设计crisprbrownlabtools.otago.ac.nz/crisprtarget/crispr_analysis.htmlzifit targeter software设计crispr/zifit/chopchop设计 crispr 和 talencrispr-p设计植物crispr/crispr/crispr-plant设计植物crispr/crispr/index.htmlgenome enginee

34、ring resources设计crispr及其他资源/crispr相关资源/rgen tools设计crispr并搜索脱靶位点/casot搜索crispr脱靶位点/casot/cas-offinder搜索crispr脱靶位点/cas-offinder/addgene质粒共享平台白提供了结构基础。由于tale蛋白dna结合域的高度串联重复特性,使ta

35、le表达载体的合成和搭建具有一定困难。科研人员开发了多种方法，包括简单直接的模块组装法19、golden gate组装方法2、高通量合成tale 的固相组装21和不依赖连接的克隆方法22等。 golden gate组装方法利用iis型限制性内切酶切割位点位于识别序列外部的特性，各个 tale重复单元质粒经酶切后产生不同的4nt粘性末端，具有兼容粘性末端的 dna片段可按照正确顺序连接成完整的多rvd模块。表1汇总了当前各种 talen辅助设计程序。2.3 crispr/cas 系统组成及构建方法crispr/cas系统是在细菌的天然免疫系统内发现的，广泛存在于细菌及古生菌中，主要功

36、能是抵抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas系统由crispr序列与cas基因家族组成，其中crispr由一系列高度保守的重复序列(repeat)与间隔序列(spacer)相间排列j组成。在crispr序列附近存在高度保守的 crispr 相关基因(crispr-associated gene, cas gene),这些基因编码的蛋白具有核酸酶功能，可以对dna序列进行特异性切割23,24。根据cas基因核心元件序列的不同，crispr/cas 可以分为i型、n型和出型系统 23。这3类系统又可以根据其编码 cas蛋白而分为更多的亚类。i型和出型crispr/cas免疫系统需

37、要多个cas蛋白形成的复合体切割 dna双链，而n型只需要 1个cas9 蛋白。cas9蛋白包含氨基端的 ruvc-like结构域及位于蛋白中间位置的 hnh核酸酶结构域，hnh核酸酶结构域切割与单导向rna (single guide rna,sgrna)互补配对的模板链，ruvc-like结构域对另1 条链进行切割。切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif, pam)上游 3nt 处。自 2012年起，人们优化了 n型 crispr/cas系统，禾u 用cas9蛋白和sgrna构成简单的sgrna/ cas9系统25, 26,使其能够

38、在真核生物中发挥类似zfn和talen那样靶向切割 dna的作用(图1c)。cas9蛋白与sgrna结合形成rna-蛋白质复合体，共同完成识别并切割dna靶序列的功能。其中，cas9蛋白作为核酸酶切割双链dna ,而sgrna则通过碱基互补配对决定靶序列的特异性。2014 年，链球菌(streptococcus pyogeneg和放线菌(actinomyces naeslundii ) cas9蛋白的三维晶体结构被解析出来27,28。结果发现，cas9家族的成员具有相同的核心结构，这一结构可以裂开两瓣形成钳状，一瓣负责目标识别，另一瓣具有核酸酶活性能切断dna。两瓣中间有1个带

39、正电的沟槽，可以容纳sgrna:dna异源双链分子。目标识别瓣对于结合sgrna和dna是必须的，而核酸酶瓣包含 hnh 和ruvc核酸酶结构域，它们所处位置恰好可以分别切开一条dna链。cas9蛋白单独存在时处于非活性状态，但与sgrna结合后，它的三维结构会经历剧烈的改变，允许 cas9与目标dna结合。这一结构可以帮助改良 cas9核酸酶，设计不影响其功能的小cas9变体，使其更适合基础研究和基因工程。目前已积累了大量的crispr靶位点设计网络程序，详见表1。2.4 zfn、talen 和 crispr/cas9 系统的比较及选择3种ssns技术相比较，在效率、特异

40、性及设计上各有不同。由于锌指单元同其靶序列的对应性并不特异，zfn表现出较明显白脱靶效应 (off-target effect),并且获得有效的 zfn相当困难，这两点严重妨碍了该技术的广泛应用。talen和crispr/cas9系统相互补充，各具优点：talen优势是特异性高，脱靶效应较低，但 talen蛋白较大，并且序列重复性强，表达载体构建较为繁琐；crispr/cas9系统在设计和构建上更为简单，突变不同的靶位点时仅需重新设计、合成与靶序列互补的sgrna,而不需要更换 cas9核酸酶，为crispr/cas9系统应用提供了极大便利。由于sgrna与靶位点通过核甘酸配对相

41、互识别，个别核甘酸位点改变并不会对该系统的突变活性造成显著影响，因此， crispr/cas9 系统的特异性较talen稍差。目前zfn基本上被 talen和crispr/cas9替代。talen的优势是特异性高，脱靶效应较低；而 crispr/cas9系统的优势则是使用简便、成本低(表2)。在动物或人类的基因治疗等应用中，ssns脱靶效应可能造成致命后果。然而在植物中脱靶效应不是主要制约因素，可以通过全基因组测序检测是否存在脱靶，或者通过与亲本多次回交的方法去除脱靶突变。另据报道，crispr/cas9系统在植物中没有严重的脱靶突变29,30,而且目前已有多种方法可以在一定程

42、度上减少 crispr脱靶，提高靶向特异性。因此，从简便、效率和多基因编辑角度考虑，3种ssns中首选 crispr/cas9, talen次之。在基因组编辑以外的其他领域，tale效应因子相对更容易与其他功能结构域融合，行使靶向激活、抑制和表观修饰等功能；将无核酸酶活性的dcas9(deadcas9)与功能蛋白融合，也能赋予crispr系统多种功能，但sgrna由rna聚合酶出转录，目前没有可精确调控的sgrna启动子，因此，从可扩展性及精细调控方面tale略胜一筹31。3基因组编辑技术在植物生物学及分子育种研究中的应用3.1 基因敲除基因敲除是基因组编辑最简单的应用形式，只

43、需要ssns在靶位点制造1个dsb断裂。利用ssns 基因敲除的植物种类括拟南芥、烟草、矮牵牛 (petunia hybrida)、水稻、大豆、玉米和小麦等(表3)。963遗传 hereditas (beijing)2015第37卷表 2 zfns 、 talens和crispr心as9系统比较比较项目zfnstalenscrispr/cas9结合原则蛋白-dna蛋白-dnarna-dna核心元件zfa- fok itale- fok isgrna, cas9花费（成本）高相对较高低组装难易程度困难比较困难但已有改进简单、快速构建载体时间 7 d57 d3 d靶位点长度（bp）1836 (2

44、x或 2x18)2260 (2 x 1130)23 （包含pam序列）对靶位点限制富含g区域以t开始a结束以ngg 或nag 序列（pam）结束靶位点密度每100 bp序列1个靶位点很高每8 bp含有1个靶位点（ngg pam）成功率低高高平均突变效率低并且差异很大（10%）高(20%)高(20%)脱靶频率高低变异较大基因长度（kb）1 x 23x 24.2 spcas9; 0.1 sgrna蛋白大小（kda）40105160多基因编辑困难困难容易表3植物基因组编辑汇总基因修饰类型 ssn类型物种靶基因转化方法参考文献体外酶切实验talen拟南芥pds3无107瞬时luc基因实验talen拟

45、南芥cruciferin3农杆菌介导法108瞬时yfp基因实验talen烟草nptiipeg法转化原生质体109nhej启动子突变talen水稻os11n3启动子农杆菌介导法33nhej启动子突变talen大麦hvpaphy_a启动子农杆菌介导法110nhej基因敲除zfn烟草als (sura, surb)电穿孔11nhej基因敲除zfn拟南芥adh1、tt4农杆菌介导法32nhej基因敲除zfn拟南芥abi4农杆菌介导法5nhej基因敲除zfn大豆egfp、dcl4a、dcl4b 等 a. rhizogenes 介导法111nhej基因敲除talen拟南芥adh1peg法转化原生质体19n

46、hej基因敲除talen拟南芥adh1、tt4、mapkkk1等农杆菌介导法51nhej基因敲除talenosbadh2、osdep1、bdckx2水稻、二穗短柄早农杆菌介导法52等nhej基因敲除talen烟草als (sura, surb )peg法转化原生质体48nhej基因敲除talen大豆fad2-1a、fad2-1ba. rhizogenes 介导法35nhej基因敲除talen小麦mlo1基因枪36nhej基因敲除talen大麦gfp农杆菌介导转化胚性花粉细胞112nhej基因敲除talen玉米pds、ipk1a、ipk、mrp4 农杆菌介导法113nhej基因敲除talen番

47、茄pro农杆菌介导法114nhej基因敲除crispr心as拟南芥gai、bri1、jaz1等农杆菌介导法30nhej 基因敲除crispr/cas拟南芥gfp农杆菌介导法115nhej 基因敲除crispr/cas拟南芥ft农杆菌介导法116nhej基因敲除crispr心as拟南芥adh1农杆菌介导法117nhej基因敲除crispr心as拟南芥、水稻atbri1、osroc5、osspp等农杆菌介导法39nhej基因敲除crispr心as拟南芥、水稻atchli1、atchli2、attt4,农杆菌介导法118osmyb续表基因修饰类型 ssn类型物种靶基因转化方法参考文献nhej基因敲除

48、crispr心as拟南芥、烟草pds3、fls2、rack1农杆菌介导法37nhej基因敲除crispr心as拟南芥、水稻、高粱 mgfp、sweet11、sweet14农杆菌介导法119nhej基因敲除crispr心as烟草pds农杆菌介导法38nehj 基因敲除crispr/cas烟草pds、pdr6农杆菌介导法120nhej 基因敲除crispr/cas水稻cao1、lazy1农杆菌介导法42nhej基因敲除crispr心as水稻myb1、ysa、roc5等农杆菌介导法29nhej 基因敲除crispr/cas水稻mpk5peg法转化原生质体41nehj 基因敲除crispr/cas水稻

49、sweet11, 13, 1a, 1b农杆菌介导法53nhej基因敲除crispr心as水稻、小麦ospds、tamlo基因枪40nhej基因敲除crispr心as小麦、烟草tainox、tapds、nbpds农杆菌介导法121nhej 基因敲除crispr/cas玉米ipkpeg法转化原生质体113nhej 基因敲除crispr/cas地钱arf1农杆菌介导法122nhej基因敲除crispr心as甜橙pds农杆菌介导法123nhej基因敲除crispr心as番茄ago7农杆菌介导法124nhej基因删除和侄j位zfn拟南芥rpp4基因簇农杆菌介导法50nhej基因删除和侄j位talen水

50、稻badh2基因枪52nhej基因删除talen拟南芥gll22基因簇农杆菌介导法51nhej基因删除crispr心as小麦、烟草tainox农杆菌介导法121nhej 基因删除crispr/cas拟南芥tt4农杆菌介导法118nehj 基因删除crispr/cas烟草pds农杆菌介导法120nhej基因删除crispr心as水稻sweet1, 11, 13, 14农杆菌介导法53nhej多基因敲除talen水稻badh2、ckx2, dep1基因枪34nhej多基因敲除crispr心as拟南芥try、cpc、etc2农杆菌介导法54nehj基因替换zfn拟南芥、烟草qqr-zfn农杆菌介导法

51、125nhej基因插入talen小麦mlo1基因枪36ssa基因修复crispr心as拟南芥guus农杆菌介导法30hr核昔酸插入crispr心as水稻pdspeg法转化原生质体40hr核昔酸插入crispr心as烟草pds3农杆菌介导法37hr核昔酸替换zfn拟南芥ppo农杆菌介导法126hr核昔酸替换zfn烟草sura、surb电穿孔46hr核昔酸替换和基因插入talen烟草als (sura、surb)peg法转化原生质体48hr基因插入crispr/cas拟南芥adh1农杆菌介导法117hr基因插入zfn玉米ipk1whisker介导法47hr基因插入zfn烟草chn50农杆菌介导法1

52、27hr基因叠加zfn玉米ccr5、aavs1、rosa26、prmt1 基因枪128?194-201s chiiaunronni* nuseall ritihlsdklh胖 izhang 等 32 用 open(oligomerized pool engi- neering)方法设计zfn敲除拟南芥 adh1和tt4基因，并利用雌激素诱导启动子表达，ti代分另有7%和16%的植物含有体细胞突变，突变能够稳定传递到后代，并获得20%纯合突变植物。纯合adh1突变体具有预期丙烯醇抗性，而tt4突变体种皮因缺失花青素而呈现黄色。li等33利用talen方法突变水稻蔗糖外排转运基因ossw

53、eet14启动子区域，破坏细菌性病原菌分泌的效应蛋白在基因组上的结合位点，从而提高第10期单奇伟等：植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展967水稻白叶枯病抗性。shan等34对水稻甜菜碱乙醛脱氢酶基因（osbadh2）的编码区设计 talen , badh2 纯和突变体稻米2ap含量显著增加，提高了稻米的香味品质。haun等35利用talen方法同时敲除大豆脂肪脱氢酶 2基因家族两个成员 fad2-1a和 fad2-1b,纯合突变体（aabb）油酸含量从20%提高到 80%,并同时降低对人体健康有害的亚油酸含量（从50%到4%）,因此改善了大豆油的品质。wang等36,37利用ta

54、len方法同时敲除 mlo基因在小麦 a、b和d基因组上的3个拷贝，获得对白粉病具有广谱和持久抗性的纯合小麦突变体tamlo-aabbdd。crispr/cas9系统具有简捷和高效特性，目前已在多个植物中得到应用，如拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、小麦、甜橙（citrus sinensis ）和番茄（solanum lycopersicum）等（表3）。在拟南芥和烟草原生质体中，nhej突变效率分别达到5.6%和38.5%38。此外，利用农杆菌侵染方法稳定转化拟南芥，ti植物中有26%84%突变效率39。shan等40利用水稻偏爱密码子优化cas9核酸酶基因，并采用水稻小核 rn

55、a的u3启动子和小麦 u6启动子转录 sgrna , 定点敲除水稻pds和小麦mlo等基因，在t0代就获得纯合基因敲除水稻突变体，突变效率达到10%。 xie等41在水稻原生质体中检测到3.5%10.6%突变效率，植物中突变效率为3%8%。miao等42分别敲除水稻叶绿素 a加氧酶基因cao1和控制分篥夹角的lazy1基因，ti代纯合cao1和lazy1突变体分别呈现叶片叶绿素含量降低和分菜夹角增大表型。3.2 基因插入和定点替换一般情况下，基因插入或定点替换都可以通过 hr方式实现，转化 ssns同时引入一个供体 dna 载体或片段，供体dna包含了待插入或替换的基因或核甘酸序列并在其两侧分别含有足够长的同源 dna（同源臂）。基因定点插入所用的供体dna通常为双链环状载体或双链线性 dna;此外还可