临床医学《CRISPR介导的基因激活系统的开发及应用》博士论文

博士学位论文

CRISPR 介导的基因激活系统的开

发及应用

Development and application of CRISPR-based gene activation

systems

摘要

基因编辑系统通常依赖于诱导 DNA 双链断裂（ DSBs ） , 然而由 DSBs 引起 的

脱靶位点的突变可能会产生有害的影响，从而限制其在临床治疗中的应用。最 近

CRISPR/Cas9 系统被重新编辑并应用于基因的激活，它可以在天然染色体环 境内对

特定靶点进行基因激活而不产生 DSBs, 是一种很有潜力的治疗策略。目 前，基于卬

Cas9 已经开发多种基因激活系统，但是由于其原间隔子相邻基序 （ PAM ）的限制、

较高的脱靶效应、大体积、免疫原性等，使其在体内外的应用 存在一些局限性。

因此，我们仍需要构建不同类型的 CRISPR 激活系统，为在体 内体外实现高效的基

因激活提供新的可选择的方式。

"Cpfl 是一种 2 类 V 型 CRISPR 系统,不同于 SpCas9 识别 5'-NGG 的 PAM 序列，

它可以识别 5'-TTTV （ V 代表 A, C 或 G ）的 PAM 序列，并具有高特异 性。我们将

"Cpfl 的核酸酶结构域的关键氨基酸进行突变，并结合组蛋白乙酰 转移酶 p300, 构建

d£Z ） Cpfl-p300 激活系统。在 gRNA 的引导下，融合蛋白 dZZ>Cpfl-p300 会与靶位

点结合，并通过促进启动子和增强子区域组蛋白的乙酰 化，使染色质发生重构，

从而增强基因表达。同时，我们也将 dLBCpfl 突变体与 SunTag 系统结合，利用

SunTag 系统的中重复多肽 GCN4 和相应单链可变区抗 体（ scFv ）特异性的结合，

将融合蛋白 ScFv-VP64 招募到靶位点，使转录激活因 子 VP64 在启动子区域富集，

从而增强转录。通过这两种方式，我们基于 LbCpfl 构建了高特异性的转录激活系

统，成功在多种细胞中诱导靶基因高效的表达，拓 展了 CRISPR 激活系统的应用

范围。

QCas9 是目前发现的最小 Cas9 同源体，与卬 Cas9 相比,它具有不同的 PAM 摘

要识别序列，以及较小体积（ 984 个氨基酸，而卬 Cas9 为 1,368 个氨基酸）。因此 我

们将 QCas9 与强效转录激活因子 VPR 结合，构建一系列转录激活系统。其 中，

dQCas9-SunTag-VPR 系统可以强效的激活基因的表达； C/Cas9-VPR 系统可 以正交

性诱导基因的编辑和激活；而基于 VPR-dQCas9 系统进一步缩减和优化 后形成的小

型高效的激活体系（命名为 miniCAFE ） , 在基因插入细胞系中，单个 拷贝 miniCAFE

即可在单条 gRNA 的引导下有效的激活靶基因的表达。同时，由 于其小体积的优

势，我们可以将 miniCAFE 和 gRNA 包装在一个 AAV 载体中进 行体内传递，并成

功激活肝脏中 Fgf21 的表达，调节成年小鼠的能量代谢。因此， miniCAFE 为体内

诱导基因的表达提供了一种新的方法。

综合而言，我们基于 ZiCpfl 和苛 Cas9 构建了多种转录激活系统，并由于 PAM

的不同、 EBCpfl 的高特异性、 0Cas9 的小体积以及免疫原性，这些系统各 有优势，

为基因激活系统在体内外的应用提供了有力的补充，对人类疾病的治疗 具有巨大

的潜力。

关键词 基因激活 CRISPR ZiCpfl SunTag QCas9

博士学位论文

Development and application of CRISPR-

based gene activation systems

ABSTRACT

Genomic editing systems generally rely on the induction of DNA double-strand

breaks (DSBs). However, off-target mutations caused by DSBs may have harmful effects,

which limits their applications in clinical therapy. CRISPR/Cas9 system has recently been

modified and applied to gene activation, which induces gene expression of target sites in

the natural chromosomal environment without inducing DSBs, and is a promising

therapeutic strategy. At present, a variety of gene activation systems based on 幽 Cas9 have

been developed. But due to the limitations of its PAM, high ofif^target effect, large size

and immunogenicity, there are some limitations in its application in vitro and in vivo.

Therefore, we still need to develop different types of CRISPR activation systems to

provide new and alternative approaches for efficient gene activation in vitro and in vivo.

CRISPR/Z^Cpfl is a class 2 type V CRISPR system. Unlike 阳 Cas9, which

recognizes PAM sequences 5'-NGG, Z^Cpfl recognizes PAM sequences 5-TTTV (V

represents A, C or G) with high specificity. Therefore, MCpfl (LZ>Casl2a) was

deactivated via mutagenesis in the nuclease domain and fused p300 to construct

dL6Cpfl-p300 system. Under the guidance of gRNA, dLZ>Cpfl-p300 fusion proteins bind

to the target sites and promote the acetylation of histones in the promoter and enhancer

regions, which results gene expression activation. Meanwhile, dZACpfl also combined

with Suntag system, which consists of repeating peptide GCN4 and a scFv antibody-fusion

protein. In dZ,Z»Cpfl -SunTag system, the fusion protein SCFV-VP64

ABSTRACT

can be recruited to the target site by specific binding between GCN4 and scFv, which

results the transcriptional activator VP64 to accumulate in the promoter region, thereby

enhancing transcription. Through these two approaches, we constructed a highly specific

dLbCpfl- based transcriptional activation system, which successfiilly induced the

highly efficient expression of target genes in a variety of cells, expanded the application

range of CRISPR activation system.

QCas9 is the smallest Cas9 homologue with a different PAM sequence and a

smaller size (984 amino acids compared to 1,368 amino acids of 5pCas9). Therefore, we

constructed a series of transcriptional activation systems combined with the minimal

Q'Cas9 (derived from Campylobacter jejuni, 984aa), and the potent transcriptional

activator VPR. Among them, dQCas9-SunTag-VPR system can strongly activate gene

expression; The CjCas9-VPR system can orthogonally induce gene editing and

activation. More importantly, a small and efficient activation system (named

MiniCAFE), Optimization and minimized based on dQCas9-VPR, can effectively

activate the expression of target genes by combining a single copy of miniCAFE with a

single gRNA. At the same time, due to its small size, we could package miniCAFE and

gRNA in an AAV carrier for delivery, and successfully activated the expression of

FGF21 in the liver to regulate the energy metabolism of adult mice. Therefore,

miniCAFE provides a powerful way to induce gene expression in vivo.

In conclusion, we have constructed a variety of transcriptional activation systems

based on LbCpfl and C/Cas9. Due to the characteristics of these two systems, such as

different PAM, high specificity of Z&Cpfl, small size of Q'Cas9 and immunogenicity,

these systems have different advantages and provide a powerful supplement for the

application of gene activation systems in vitro and in vivo, and has great potential for the

treatment of human diseases.

KEYWORDS ： Gene activation ； CRISPR ； "Cpfl ； SunTag ； QCas9

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目录

摘要 .......................................................... I

ABSTRACT ................................................. i

前言 .......................................................... 1

第一章 利用 CRISPR/Z^Cpfl 构建高特异性的激活系统 ............. 18

前言 ............................................................ 18

1.1 材料与方法 ................................................... 19

1.2 实验方法 ..................................................... 21

1.3 统计学分析 ................................................... 37

1.4 实验结果 ..................................................... 37

1.5 讨论 ......................................................... 46

1.6 本章小结 ..................................................... 50

第二章利用 CRISPR/QCas9 构建小而高效的激活系统及其应用 51

前言 ............................................................ 51

2.1 材料与方法 ................................................... 53

2.2 实验方法 ..................................................... 54

2.3 统计学分析 ................................................... 80

2.4 实验结果 ..................................................... 80

2.5 讨论 ........................................................ 104

2.6 本章小结 .................................................... 106

参考文献 .................................................... 107

攻读学位期间成果 ............................................ 122

致谢 ........................................................ 123

南方医科大学学位论文原创性声明 ........................................................ 124

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前言

一、 CRISPR 系统

在自然界中，成簇规则间隔的短回文重复序列( CRISPR) 和 CRISPR 相关 基因

(Cas) 系统是原核生物用于裂解入侵核酸的一种适应性免疫机制 n-3 ］。细菌 和古细

菌中存在着各种各样的 CRISPR/Cas 系统，它们的成分和作用机制各不相 同，例如，

第 1 类 CRISPR 系统由多蛋白效应复合物构成，而第 2 类系统则利用 单一蛋白效应

物。 CRISPR 系统整体分为六个类型和多种亚型，并且各种亚型正 在快速扩增［ 4,5 】。

所有 CRISPR 系统都依赖于 CRISPR RNA (crRNA) 或者定制 的向导 RNA (gRNA) 进

行靶向， crRNA 的间隔序列与靶序列互补杂交后释放的 能量会使 Cas 的构象发生改

变，从而具有核酸酶活性。 Cas 核酸酶的另一个所需 要素是原间隔子相邻基序

( PAM)( 或 VI 型系统中的原间隔子侧翼序列( PFS)), 它是 Cas 介导的裂解所需的短特

异性序列，位于靶序列之后［ 6 ］。因此，我们可以 通过设计含有合适间隔序列的

gRNA, 利用 CRISPR 系统对含有 PAM 或 PFS 的 核酸序列进行位点特异性切割。由

于 CRISPR 系统的简易性和特异性，使其迅速 地应用于基础科学、转化医学等领域，

如解释遗传疾病的机制〔 7, 队寻找药物靶 点开发动物疾病模型［丄 12 ］以及植物基

因工程［ 13,14 ］等。同时，除具有核酸酶 活性外， CRISPR 系统还是一个独特的平

台，可以将蛋白和 RNA 分子招募到靶 位点，利用这个特性， CRSPR 系统被开发成

多种工具，广泛应用于基因调控 g 16 ］、表观遗传编辑［心 9 ］、染色质相互作用

［ 2 。， 21 ］和活细胞成像［ 22-24 ］等多个领域。

由于利用单一蛋白效应物提供的优势，第 2 类系统是目前在生物学研究中 应用

最广泛地 CRISPR 工具。第 2 类又进一步细分为 II, V 和 VI 三种类型，每 种都使用

不同类型的 Cas 蛋白。大多数 II 型 Cas9 同源体和 V 型 Casl2 同源体 具有 RNA 引导

的 DNA 核酸内切酶活性，而 VI 型 Casl3 变体显示出优先的 RNA 靶向和切割活性。

1.

CRISPR/Cas9 系统

Cas9 属于 2 类 II 型 CRISPR 系统，它由两部分 RNA 进行向导：一个 crRNA 负

前言

责 DNA 靶向，另一个反式激活 crRNA （ tracrRNA ）负责与 Cas 结合形成复合 物，

同时， crRNA 可以和 tracrRNA 互补配对结合，目前在实验应用中，这两部 分均

可被合成的 gRNA 代替。其中， 5pCas9 （来源于酿脓链球菌）是第一个成功 在真

核细胞中使用的 CRISPR 系统［ 25 】，也是目前最常用的 Cas9° 辭京 9 依赖于 20

个核昔酸的间隔序列以及 5'-NGG 的 PAM 靶向 DNA, 并产生一个钝的双链 断裂

（ DSB ） ［ 26 】。

5'-NGG 的 PAM 的识别限制了所 Cas9 的靶位点的选择，为增加靶位点的可 用

性，人们通过定向改进的方法产生了许多可以识别不同 PAM 序列的变体。同 时，

具有不同 PAM 序列的其他 Cas9 同源体的发现和开发也提供了更多的靶位 点选择。

例如， S 〃 Cas9 （来源于嗜热链球菌）识别的 PAM 序列为 53NAGAAW （ W 代表

A 或 T ） VI, M«eCas9 （来源于脑膜炎奈瑟氏球菌）识别的 PAM 序列 为 5 ，

-NNNNGATT ［ 28 ］。这些 Cas9 同源物均己被应用于靶向细菌和哺乳动物细胞 中

的基因组。此外， SaCas9 （来源于金黄色葡萄球菌）识别的 PAM 序列为 5'-

NNGRRTCR 代表 A 或 G ）

［ 29 ］ o 值得注意的是, SaCas9 基因的编辑效率与 SpCas9 相

当，并且 SaCas9 的体积较小（ 1,053 个氨基酸，而町 Cas9 为 1368 个氨基酸），使

其可包装于大小受限的腺相关病毒（ AAV ）载体中，便于体内应用。此外，目 前

发现最小的 Cas9 同源体 0'Cas9 （来源于空肠弯曲菌， 984 个氨基酸）可以识 别

PAM 序列为 5'-NNNVRYM （ V 代表 A, C 或 G ； Y 代表 C 或 T ） , 并成功应 用于

体内基因编辑［ 3° 】。

2.

CRISPR/Casl2 系统

Casl2 是另一种 2 类 RNA 引导的核酸内切酶，作为 V 型系统， Casl2 蛋白 仅

具有单个 RuvC 样核酸酶结构域，该结构介导靶 DNA 的切割（如图 1 ）。许多 Casl2

核酸酶天然地由单个 crRNA 介导，不需要额外 tracrRNA 。此外， Cas 12 核 酸酶

通常在远离 PAM 的间隔序列区域内产生 5, 突出的交错切口。这些特点均与 产生

平末端的 Cas9 形成对比，如图 1 。

Casl2a （也称为 Cpfl ）是第一种 Casl2 核酸酶，己被广泛用于基因编辑⑶〕。

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3

Casl2a 能够利用独立的核酸酶结构域从阵列中生成单个 crRNA, 这种加工能力 有利

于简化需要多个 crRNA 的多基因编辑系统 DR 。 Casl2a 同源体通常使用富含 T 的

PAM 序列，与大多数 Cas9 同源体的 PAM 序列正交。其中， 4sCasl2a （来 源于氨

基酸球菌属）和毆 Casl2a （来源于毛螺菌属）是目前最常用的 Casl2a 同 源体，识

别 5'-TTTV 的 PAM 序列。同时基于 4sCasl2a 和 "Casl2a, 目前己经 设计了许多变体，

充分提高基因编辑活性，扩大靶向范围 EL Casl2a 独特的功 能和切割机制使其成为

一个很有前景的基因组编辑工具，扩展了 CRISPR 系统。

此外也存在一些 Casl2 同源体可以有效地切割单链 DNA 靶点，例如 Casl2f （也

称为 Casl4 ） Bl 。还有一些 Casl2 同源体，如 Casl2b （也称为 C2C1 ）和

Casl2i, 则更倾向于使双链 DNA 的非靶向链产生切口 ,而不是形成双链断裂， 从而

导致较低的编辑效率 "36 ］。当然，基于 Casl2b, 已经设计了新的变体，使 其能更有

效的切割双链 DNA ，。 Casl2e （也称为 CasX ） , 目前也己经在细菌和 人类细胞得到

较广泛的应用 "39 ］。据报道，近期发现的小体积的 Casl2j （也称为 Cas （ D ）也能

对双链 DNA 进行切割，但活性较低 Ho 】。

此外， Casl2 的一些同源体，包括 Casl2a, 在与靶 DNA 识别并激活其核酸 酶活

性后，会非特异性的切割周围的单链 DNA 或 RNA, 目前这种裂解活性已经 被应用

于核酸检测 DM 】］。尽管大多数 Casl2 同源体靶向并切割 DNA, 但还有一 些 Casl2

同源体（例如 Casl2g ）是 RNA 引导的 RNA 切割酶，在激活后会同时 表现出附带的

RNase 和 DNase 活性

［ 36 - 42 ］ o

3.

CRISPR/Casl3 系统

Casl3 属于 2 类 VI 型 CRISPR 系统，是专门靶向 RNA （而非 DNA ）的 CRISPR/Cas

免疫系统，它展现岀作为 RNA 调控和检测工具的巨大应用前景。到目前为止, Casl3

主要分为四个亚型, VI-A （ Casl3a, 也称为 C2c2 ）、 VI-B （ Casl3b /C2c6 ） , VI-C

（ Casl3c/C2c7 ），和 VI-D （ Casl3d ）

［ 35 ' 43 ］

O 虽然这些亚型在大小 和序列上都有

很大的差异，但它们都有一个共同的特征，即存在两个 HEPN 域， 它们共同形成一

个复合 RNA 核酸酶活性中心，一方面负责加工处理前体 crRNA

总页数：130

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