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开发紫外可见报告辅助 CRISPR/Cas9 基因编辑系统来改变野菊花的开花时间,Plant Biotechnology Journal

来源：花匠小妙招时间：2024-11-22 03:58

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是世界范围内重要的经济观赏作物。这种典型的菊科（菊科）专性短日照（SD）多年生草本植物是研究开花的光周期控制的有用模型。然而，菊花复杂的杂合基因组和该物种的自交不亲和性阻碍了其园艺和生理特性的基础和应用研究。

分离和表征特定基因中的突变体对于剖析基础和应用研究的基因功能至关重要。在菊花基因组编辑的第一份报告中，TALENs 同时靶向6 个CmDMC1（减数分裂控制破坏）基因（Shinoyama等， 2020）。然而，序列特异性TALEN的设计很麻烦，并且所需的重组质粒很大。在这方面，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑在载体设计和组装方面具有优势，特别是在靶向多个基因时，已广泛应用于许多生物体中。然而，高频率的嵌合事件和低编辑效率阻碍了CRISPR/Cas9系统在菊花中的应用(Kishi-Kaboshi et al ., 2017 )。只有一项研究报告使用传统 CRISPR/Cas9 介导的系统成功敲除菊花 ( C. morifolium ) 中的 TCP 转录因子基因（Li等人， 2022）。

野菊花（Chrysanthemum indicum L.）是栽培菊花的祖先，常被用作栽培菊花的模型，并且作为保健食品和抗炎中药已有2000多年的历史。在本研究中，我们选择二倍体C. indicum作为材料 (2 n = 2 x = 18)（图 S1），并首先靶向其单拷贝八氢番茄红素去饱和酶( CiPDS ) 基因。我们将基于CiPDS序列（图 1a、b）的 4 个单引导 RNA（sgRNA）克隆到 pDIRECT-22C 中，该 pDIRECT-22C 可以使用 Csy 型核糖核酸酶 4（Csy4）酶同时表达多个 sgRNA（Čermák 等， 2017 ））。我们通过高通量测序测量了C. indicum原生质体中每种 sgRNA 的编辑效率（数据 S1）。sgRNA1-4的编辑效率分别为8.22±1.2%、7.82±0.3%、4.02±0.4%和9.14±1.0%（图1b）。我们选择 sgRNA1 和 sgRNA2 来敲除CiPDS，因为它们具有最高的编辑效率并靶向第一个CiPDS外显子（图 1a）。

图1

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使用紫外可见报告辅助 CRISPR/Cas9 系统对野菊进行基因组编辑。(a) CiPDS 基因结构和编辑目标。(b) 通过高通量测序在 C. indicum 原生质体中测试的四个 CiPDS sgRNA 靶标的编辑效率。(c) 使用不同启动子和密码子优化的 Cas9 构建的工程载体的编辑效率。(d) Cipds 突变体的表型。(d1) Cipds 双等位基因突变体的浓密表型；(d2和d3)嵌合植物。(e) 使用 Cipds 创建的突变体的基因分型（三个纯合或双等位基因系）。(f) 35S:eYGFPuv C. indicum 在紫外光下的表型：整株植物 (f1)、花 (f2) 和根 (f3)。（G）。pDIRECT-Ci-opti-CiPDS-eYGFPuv 载体示意图。(h) 通过检查 eYGFPuv 荧光在 35S:eYGFPuv 植物中筛选 CiPDS 编辑的植物。(h1) WT 和 35S:eYGFPuv 愈伤组织和幼苗中 eYGFPuv 荧光的观察。红色圆圈表示再生的植株。(h2)用pDIRECT-Ci-opti-CiPDS-eYGFPuv转化的35S:eYGFPuv愈伤组织的荧光。箭头指示没有荧光的 35S:eYGFPuv 愈伤组织，显示白化表型。(h3–h5)用 pDIRECT-Ci-opti-CiPDS-eYGFPuv 转化后 35S:eYGFPuv 再生植株的荧光。(h3) 中的箭头表示失去 eYGFPuv 荧光并表现出红色荧光的小植株。(h4) 没有 eYGFPuv 荧光的植株表现出白化表型。(h5)嵌合小植株。箭头表示在幼苗再生的早期阶段具有荧光的区域。(i)使用潮霉素对T0植物的筛选效率以及遗传转化后用于选择的荧光损失。†选定的植株是具有潮霉素抗性或荧光丧失的 T0 植株。‡双等位基因突变体筛选效率（%）=（Cipds双等位基因突变体/选定的植株）×100%。(j) CiTFL1a 和 CiTFL1b 的基因结构，以及 Citfl1a 和 Citfl1b 突变体的基因分型。(k) Citfl1a 和 Citfl1b 的开花表型。(l) SD 条件下 Citfl1a 和 Citfl1b 的花芽出现时间。进行了三个独立实验。数据为平均值±标准差。*** 根据学生t检验， P < 0.001 。

由于最佳启动子的选择对于高效基因组编辑非常重要，因此我们测试了五种不同的启动子来驱动Cas9和 sgRNA（图 1c）：花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S、Cestrum黄叶卷曲病毒 (CmYLCV)、欧芹( Petroselum Crisum )泛素( PcUbi )、拟南芥 YAOZHE ( YAO ) 和C. indicum 泛素( CiUbi ) 启动子。我们还根据拟南芥( AtCas9 ) 和印度C. indicum ( CiCas9 )的密码子使用对Cas9进行了密码子优化。我们在至少两次独立实验中测试了所得九个构建体的编辑效率（表S1）。总共，我们通过根癌农杆菌介导的转化用九种构建体转化了 7786 个C. indicum叶盘（图 1c）。含有35S:AtCas9和PcUbi:sgRNA 的构建体在所有实验中显示出最高的编辑效率，并被命名为 pDIRECT-Ci-opti（图 1c 和表 S1 中的构建体 5）。

我们通过 pDIRECT-Ci-opti 转化获得了八株白化植物，双等位基因编辑效率为 0.74%（图 1c）。一株白化植物表现出浓密的表型（图1d1），而大多数植物发育出正常的根和叶（图1e）。桑格测序显示，白化植物中的所有突变仅发生在 sgRNA1 靶位点，并且由缺失和插入组成（图 1e 和图 S2）。

在生成的 14 株白化植物中（图 1c），有 4 株表现出杂色表型（28.6%），表明嵌合水平较高（图 1d2、d3）。当使用CiPDS作为视觉标记来验证基因组编辑时，嵌合现象很容易进行评分，但对于大多数没有视觉突变表型的目标基因来说，评分既费时又费力。为了进一步提高筛选效率并解决嵌合问题，我们生成了表达eYGFPuv（35S：eYGFPuv ）的转基因C. indicum，其编码的蛋白质在紫外（UV）光下具有肉眼可见的明亮荧光（Chin等人，2015 ）。， 2018）并已被用作植物中基因表达和稳定转化的可见报告基因（Yuan等， 2021）。35S：eYGFPuv C. indicum植物的所有器官均表现出荧光（图 1f）。然后，我们用特定的 sgRNA 靶向eYGFPuv，将其用作可见标记，以有效筛选基因编辑植物，同时消除嵌合植物。我们将CiPDS sgRNA1 和 sgRNA2 以及eYGFPuv sgRNA1 和 sgRNA2 克隆到 pDIRECT-Ci-opti 中（pDIRECT-Ci-opti-CiPDS-eYGFPuv，图 1g），并将该构建体转化为35S：eYGFPuv叶盘。虽然来自35S : eYGFPuv C. indicum 的叶盘表现出明亮的荧光，但来自野生型 (WT) 的叶盘在紫外光下不表现出荧光（图 1h1）。用 pDIRECT-Ci-opti-CiPDS-eYGFPuv 转化后，一些35S : eYGFPuv衍生的愈伤组织缺乏 eYGFPuv 荧光，表明它们含有eYGFPuv突变（图 1h2）。此外，一些再生的非荧光小植株不是白化的（图1h3），表明这些小植株是eygfpuv双等位基因突变体，而不是Cipds双等位基因突变体。其他没有荧光的再生植株是白化的（图1h4），表明它们是eygfpuv Cipds双等位基因突变体。我们还根据 eYGFPuv 荧光鉴定了杂色小植株（图 1h5）。

采用传统的抗生素筛选方法，我们获得了50株抗潮霉素转基因植株。其中，我们鉴定了8个Cipds双等位突变体，双等位突变体筛选效率为16.0%（图1i）。我们还选择了 11 株没有 eYGFPuv 荧光的植物，它们是eygfpuv双等位基因突变体。其中，7名白化病患者，eygfpuv双等位基因突变体筛选效率为63.6%（图1i）。因此，使用突变的eYGFPuv作为可见标记提高了筛选效率并很大程度上消除了嵌合植物。

菊花的开花通常需要人工调节日长。菊花育种的主要目标之一是培育光周期不敏感或早花的菊花品种。TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) 抑制菊花开花。过度表达TFL1会延迟菊花的开花时间（Gao等， 2019；Higuchi 和 Hisamatsu， 2015）。在这里，我们在C. indicum中鉴定了两个TFL1同源物：CiTFL1a和CiTFL1b。我们使用 CRISPR/Cas9 平台生成了三个Citfl1a双等位突变体和一个Citfl1b纯合突变体。三个Citfl1a双等位基因突变体在第一个CiTFL1a外显子中包含小的缺失和插入。Citfl1b突变体在两个基因拷贝的第三个CiTFL1b外显子中包含相同的 1-bp 插入（图 1j 和图 S3）。编辑后的植物表现出不同程度的早期开花，其中Citfl1a突变体表现出最早的开花（图 1k）。在 SD 条件下，WT 植物的花芽出现时间为 41.3 ± 1.2 天，而Citfl1a和Citfl1b植物的花芽出现时间分别为 16.7 ± 0.6 和 32.7 ± 1.2 天（图 1l）。

本研究开发的可见报告辅助CRISPR/Cas9系统应有助于菊花的研究和育种。

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