三七几丁质酶基因PnCHI1的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域相关技术，特别是一种三七几丁质酶基因pnchi11的应用。

背景技术：

植物在生长发育过程中会受到许多生物和非生物因子的胁迫，如干旱、寒冷、uv射线、创伤、病原物（真菌、细菌、病毒）侵染等，为此生物进化出一系列防御机制来抵御逆境胁迫，病程相关蛋白（pathogenesis-relatedprotein,pr）的激活和积累是植物防御反应的重要组成部分（singha，kirubakaransi，sakthiveln.heterologousexpressionofnewantifungalchitinasefromwheat.proteinexprpurif，2007，56(1):100.）。植物表达多种病程相关蛋白基因以应对病原菌等多种逆境因子的危害，其中pr3基因家族编码的几丁质酶(chitinase)在植物抗病防卫反应中备受关注。

几丁质，又称甲壳素或甲壳质，是由n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)通过β-1,4糖苷键连接而成的线性多糖，是地球上仅次于纤维素的第二丰富的生物聚合物。它存在3种形式，分别为α-几丁质、β-几丁质和γ-几丁质，这些不同形式的几丁质在组装和相邻链的极化方面有所不同（bussinkap,speijerd,aertsjmfg,etal.evolutionofmammalianchitinase(-like)membersoffamily18glycosylhydrolases.genetics,2007,177(2):959-970.）。α-几丁质是其主要的存在形式，由n-乙酰葡萄糖胺以反向平行的方式线性排列而成，β-几丁质是由两条同向平行链排列形成的，而γ-几丁质则是由3条链组成，两条同向，一条反向（王士奎,王汉潜.几丁质及脱乙酰几丁质的微生物降解作用.微生物学通报,1994,21(3):180-183.）。几丁质酶是一类可水解几丁质的大小分布于20-90kd的糖基水解酶（bhattacharyad,nagpurea,guptark.bacterialchitinases:propertiesandpotential.criticalreviewsinbiotechnology,2007,27(1):21-28.）。其中微生物几丁质酶多为20～60kd，植物几丁质酶在20～45kd内，昆虫几丁质酶为40～85ku。植物几丁质酶存在于植物的茎、种子、花中，它们的表达存在组织特异性。大多植物几丁质酶相对分子质量都比昆虫几丁质酶相对分子质量小，其中最小的几丁质酶大小为22kd。根据作用于几丁质酶的方式不同，可以将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶两大类，根据初级序列和催化机制可以把几丁质酶分为糖苷水解酶18家族和糖苷水解酶19家族，根据氨基酸序列的相似性和几丁质结合结构域的有无可把几丁质酶分为7大类：classi~classvii。典型的几丁质酶具有一个n端信号肽（signalpeptide）、一个催化结构域（catalyticdomain）和只存在于液泡几丁质酶中的c端结构域（c-terminalextension）。有些几丁质酶n端信号肽含有一个或者多个富含半胱甘酸的几丁质结合域（chitin-blindingdomains,cbd），此外，在cbd和催化域之间有一个可变的交联区（flexiblehingeregion）（杨海霞，邓建军，张建，等.植物几丁质酶纯化、测定及应用研究进展.食品工业科技，2011，32(6):431.）。

在健康的植物中几丁质酶在液泡和质外体连续不断的产生。几丁质酶的产生受多种生物和非生物因子的诱导，包括病原菌侵染、创伤、干旱、寒冷、臭氧、重金属、盐胁迫和紫外光等。在拟南芥（arabidopsisthaliana）中，非亲和病原物黄单胞菌(xanthomonascampestris)的侵染使叶片中classⅳ几丁质酶基因的mrna快速积累(deagerhardtlb，sachetto-martinsg，contarinimg，etal.arabidopsisthalianaclassivchitinaseisearlyinducedduringtheinteractionwithxanthomonascampestris.febslett，1997，419(1):69.)，甜菜betavulgaris接种cercosporabeticola后，classⅳ几丁质酶基因的转录水平上升。另外，植物激素乙烯（ethylene,eth）、茉莉酸（jasmonicacid,ja）、水杨酸（salicylicacid,sa）也诱导几丁质酶的表达。乙烯利可以诱导黄瓜叶片细胞间隙几丁质酶的积累，诱导的效果与黄瓜叶片对乙烯利质量浓度的感受直接相关。用茉莉酸甲酯（methyljasmonate,meja）处理人参panaxginsengc.a.meyer，人参根系几丁质酶活性与对照相比明显增高。外源水杨酸处理能够诱导香蕉musaparadisiaca几丁质酶的活性及几丁质酶基因的上调表达。

三七(panaxnotoginseng)为五加科araliaceae人参属panax植物，是我国传统名贵中药材，主产于云南文山地区。由于长期种植，三七的种质资源严重退化，同时病害也日益严重，尤其是真菌病害。主要真菌病害为根腐病、黑腐病、圆斑病、疫霉病及灰霉病，三七每年都因病虫的危害造成极其严重的损失。因此，加强三七病虫害防治是保证三七原药材产量和质量的一项主要措施。

技术实现要素：

本发明的目的是提供三七几丁质酶基因pnchi1的新用途，即在提高烟草对葡萄座腔菌（botryosphaeriadothidea）和胶孢炭疽菌（colletotrichumgloeosporioides）抗性中的应用。

本发明从三七中克隆获得的具有抗真菌活性的几丁质酶基因pnchi1的全长基因pnchi1，pnchi1的核苷酸序列如seqidno:1所示，序列长1022bp，其包含一个822bp的orf、26bp的5’-非翻译区（untranslatedregion,utr）以及174bp的3’-utr，编码一个具有273个氨基酸的蛋白质,蛋白质序列如seqidno：2所示。

本发明所述几丁质酶基因pnchi1的编码区是序列表seqidno：1中第27-848位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cdna片段，通过根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导将目的基因转入受体植物烟草中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础。发明人将这个基因命名为pnchi1。

本发明涉及分离包含pnchi1的dna片段并鉴定其功能，对该基因的序列进行分析，表明pnpgip全长cdna为1022bp，包含一个822bp的开放阅读框、26bp的5′-非翻译区(untranslatedregion,utr)及174bp的3′-utr，其中orf编码一个具有273个氨基酸的蛋白质。blastp分析表明pnchi1所编码蛋白质序列与莴苣（lactucasativa）chitinase（acx94236.1）、拟南芥（arabidopsisthaliana）classivchitinase（np_191010.1）、可可（theobromacacao）chitinase（xp_007033803.1）、欧洲大叶杨（populustrichocarpa）classivchitinase（xp_006376418.1）和辣椒（capsicumannuum）classivchitinase（ajf11981.1）同源性较高，分别为74%、73%、72%、71%和70%。pnchi1编码的蛋白质序列具有chi超家族的保守结构域，这表明其属于三七中的几丁质酶基因。超表达序列表seqidno：1所示序列可以增强烟草对葡萄座腔菌和胶孢炭疽菌的抗性。

本发明将三七几丁质酶家族基因pnchi1应用在提高烟草对葡萄座腔菌和胶孢炭疽菌抗性中，具体操作如下：

（1）采用异硫氰酸胍法提取三七叶片的总rna。以提取的rna为模板,以oligo(dt)18为反转录引物，通过逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)扩增出pnchi1编码区，然后将其连接到pmd-18t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

（2）用限制性内切酶bamhi和ecori酶切pmd-18t-pnchi1，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pcambia2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得pnchi1基因片段与pcambia2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

（3）以重组载体t-dna上具有的抗性标记筛选转化子，并通过pcr以及rt-pcr检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自三七的pnchi1基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生抗真菌的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉、药用植物等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分pnchi1转基因烟草基因组dna的pcr检测结果，其中marker为dl2000dnamarker(大连宝生物)，由2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp六条dna片段组成；阳性对照为质粒pgem-t-pnchi1为模板的pcr反应；wt为非转基因烟草(野生型，wildtype)总dna为模板进行的pcr；

图2是本发明中部分阳性pnchi1转基因烟草中pnchi1转录水平的表达分析结果图，其中marker为dl2000dnamarker(大连宝生物)；wt为非转基因烟草总rna逆转录cdna为模板的pcr产物；阳性对照：质粒pgem-t-pnchi1为模板的pcr产物；

图3是本发明中pnchi1转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b图示中的真菌分别是葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌；wt为野生型烟草的总蛋白；buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：pnchi1全长cdna克隆以及序列分析

取三年生三七叶片提取总rna，用液氮将三七叶片研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总rna，采用逆转录酶m-mlv(promega)以总rna为模板合成cdna第一链，反应体系和操作过程为：取5μgtotalrna，依次加入50ngoligo（dt），2μldntp（2.5mmeach）、depc水至反应体积为14.5μl；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μl5×first-standbuffer、0.5μlrnasin（200u）、1μlm-mlv（200u），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应。cdna第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cdna为模板，扩增目的基因pnchi1，所用上下游引物序列分别为5’ctttcataaaaatggcaaccctca3’及5’cctaacatctgaggttatcaccagg3’。采用advantagetm2pcrenzyme（clontech）扩增出目的基因；pcr反应条件：95℃1min；95℃30s，61℃30s，72℃50s,30个循环；72℃5min；反应体系（10μl）为1μlcdna、1μl10×advantage2pcrbuffer、0.5μl50×dntpmix（10mmeach）、0.2μl正向引物（10μm）、0.2μl反向引物（10μm）、0.2μladvantage2pcrpolymerasemix、6.9μlpcr-gradewater；pcr结束后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到pcr产物只有一条dna带，故直接对pcr产物进行ta克隆，使用的试剂盒为pmd18-tvectorkit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5μlpcr产物，依次加入1μlpmd18-tvector（50ng/μl）和2.5μl2×ligationsolutioni，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，amp）的lb固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增pnchi1的特异引物鉴定出多克隆位点插入pnchi1的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的pnchi1全长cdna为1022bp，通过ncbiorffinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个822bp的开放读码框（见序列表），pnchi1编码一个含273个氨基酸的蛋白质，pnchi1其蛋白质分子质量约为29.36kd,等电点(pi)约为4.77,signalp4.1分析结果表明pnchi1中存在信号肽（第1位~21位氨基酸残基）。此外，predictprotein预测分析显示pnchi1编码蛋白质为分泌蛋白，可能存在于质外体中。根据predictprotein分析结果，pnchi1蛋白中α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-strand）和无规则卷曲（loop）所占百分比分别为23.44%、6.32%和70.33%。

实施例2：植物超表达载体构建

采用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入pnchi1的大肠杆菌质粒pmd-18t-pnchi1以及植物表达载体pcambia2300s的质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶bamhi（takara）和ecori（takara）分别对质粒pmd-18t-pnchi1和pcambia2300s进行双酶切（100μl体系），反应体系和操作过程为：取20μlpmd-18t-pnchi1和pcambia2300s质粒、依次加入10μl10×kbuffer、4μlbamhi、6μlecori、60μlddh2o，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对pnchi1片段和pcambia2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒（上海生工）；取1μl回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用t4dnaligase（takara），将回收的pnchi1dna片段和pcambia2300s载体片段连接起来，反应体系（20μl）和操作过程为：取10μlpnchi1dna片段依次加入2μlpcambia2300s载体dna、2μl10×t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、5μlddh2o，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素（kanamycin，km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增pnchi1的特异引物进行pcr，挑选出pnchi1与pcambia2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用sanprep柱式质粒抽提试剂盒（上海生工）提取并纯化上述大肠杆菌中的pcambia2300s-pnchi1质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pcambia2300s-pnchi1转入根癌农杆菌lba4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpcambia2300s-pnchi1质粒加入含有200μl感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μllb液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增pnchi1的特异性引物进行pcr，检测pcambia2300s-pnchi1是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2ms培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用1/2ms培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pcambia2300s-pnchi1质粒的农杆菌lba4404菌种，接种于5ml含有50mg/lkm和20mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1ml浑浊的菌液至含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃培养48h；随后将lb固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/l的乙酰丁香酮的mgl液体培养基中，28℃振荡培养2-3h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶子切成1cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的mgl液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为ms+0.02mg/l6-ba+2.1mg/lnaa+30g/lsucrose+6g/l琼脂，22℃黑暗条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的ms筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/lsucrose+6g/l琼脂+50mg/lkm+200mg/l头孢霉素（cefotaximesodiumsalt，cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50mg/lkm和200mg/lcef的ms培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50mg/lkm的ms培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。

采用ctab法提取转基因烟草植株叶片的基因组dna，将提取的基因组dna取1μl通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组dna为模板用扩增pnchi1的特异引物进行pcr，pcr结束后，取8μl产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，pnchi1转基因烟草共筛选到47株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中pnchi1的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总rna，逆转录生成cdna第一链，并以此为模板用扩增pnchi1的特异引物进行pcr，根据pcr结果分析各转基因单株中pnchi1转录水平的表达，总rna提取以及rt-pcr的方法与实施例1中相同，pcr结束之后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到30个转基因单株中pnchi1在转录水平大量表达，这些单株的编号为t1～t30。

将实验室保存的几种真菌接种于pda固体培养基（200g/l马铃薯，15g/l琼脂，20g/l葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1g转基因烟草单株（编号分别为t2、t8、t14、t26）及野生型叶片放入研钵中，加入1ml蛋白提取液（1mnacl，0.1m乙酸钠，1%pvp，ph6），充分研磨；转入1.5ml离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30min（12,000g/min），取上清于新的1.5ml离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2μg/μl，然后分别取20μl滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价pnchi1转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，pnchi1转基因烟草蛋白对葡萄座腔菌和胶孢炭疽菌的生长具有很强的抑制作用。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>三七几丁质酶基因pnchi1的应用

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1022

<212>dna

<213>panaxnotoginseng

<220>

<221>mrna

<222>(1)..(1022)

<220>

<221>5'utr

<222>(1)..(26)

<220>

<221>cds

<222>(27)..(848)

<220>

<221>3'utr

<222>(849)..(1022)

<400>1

ggacacacccttaatctttcataaaaatggcaaccctcaatataacaaacagcttaataa60

caatacttctcgccggagtacttgccggagaattgataacagctcaagattgtggttgca120

ccgccgacctatgttgtagtcggtttggttattgtggcaacggcacagattactgtggca180

cagggtgccaaggtggtccatgttacgcaccaccaccgcaaaacggtgtttcggtttccg240

atattgttaccgatggtttctttaatgggattattgatcaagccgagtcgagttgtgccg300

gaaaagggttctactcaagggctgtttttcttgaggctcttaaatcttatccttcgtttg360

gtagggttggtacggaagatgattctaaacgtgagattgctgctttttttgcccatgcta420

ctcatgaaactggacacttttgctatatagaagagataaacggtacatctagagactact480

gtgatgaaactaacacacaatatccatgcgtaccaaataaggcctactacggccgaggcc540

caattcaactctcatggaatttcaattatgggccggccggaaaaatcatcggattcgatg600

ggctaaataatcctgaaattgtggcccaagacccggttgtttccttcaagacagccttgt660

ggtactggatgaacaatgttcaatctgccatagtttcgggccaaggtttcggggcaacca720

ttcgggccattaacggggctcttgagtgtgatggtgcaaacccggcaacggttactaatc780

gggtcaggtattacaccgagtattgtaagcagattggtgttttgcctggtgataacctca840

gatgttaggagggcaaaattgtaaggaagtgattgtaacaaataaaaggtttcaccttta900

ttattatttagctagctttaatagtatttgtccattacttgttatgtaataaattcatta960

atatcctaataataataaagtgttttggtttgtggattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1020

aa1022

<210>2

<211>273

<212>prt

<213>panaxnotoginseng

<400>2

metalathrleuasnilethrasnserleuilethrileleuleuala

151015

glyvalleualaglygluleuilethralaglnaspcysglycysthr

202530

alaaspleucyscysserargpheglytyrcysglyasnglythrasp

354045

tyrcysglythrglycysglnglyglyprocystyralapropropro

505560

glnasnglyvalservalseraspilevalthraspglyphepheasn

65707580

glyileileaspglnalaglusersercysalaglylysglyphetyr

859095

serargalavalpheleuglualaleulyssertyrproserphegly

100105110

argvalglythrgluaspaspserlysarggluilealaalaphephe

115120125

alahisalathrhisgluthrglyhisphecystyrileglugluile

130135140

asnglythrserargasptyrcysaspgluthrasnthrglntyrpro

145150155160

cysvalproasnlysalatyrtyrglyargglyproileglnleuser

165170175

trpasnpheasntyrglyproalaglylysileileglypheaspgly

180185190

leuasnasnprogluilevalalaglnaspprovalvalserphelys

195200205

thralaleutrptyrtrpmetasnasnvalglnseralailevalser

210215220

glyglnglypheglyalathrileargalaileasnglyalaleuglu

225230235240

cysaspglyalaasnproalathrvalthrasnargvalargtyrtyr

245250255

thrglutyrcyslysglnileglyvalleuproglyaspasnleuarg

260265270

cys

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctttcataaaaatggcaaccctca24

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cctaacatctgaggttatcaccagg25

相关知识

菜豆几丁质酶基因的克隆,序列分析及其表达.PDF文档全文免费阅读、在线看
含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的植物转化质粒pBG1112 构建和水稻遗传转化
几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究进展
丁子香酚和接种番茄黄化曲叶病毒对番茄几丁质酶和β
一种菊花抗旱基因及其应用的制作方法
几丁质和杀菌剂对生物防治菌生长及其防治棉花病害效果的影响
一种控制植物花瓣大小的基因及应用的制作方法
博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因及其应用的制作方法
含多种抗真菌病基因植物表达载体的构建
转基因技术在果树抗病育种中的应用

网址: 三七几丁质酶基因PnCHI1的应用的制作方法 https://www.huajiangbk.com/newsview773916.html