瓦氏秋海棠高效再生及遗传转化技术的研究

前言

秋海棠属(Begonia)是目前已知的物种多样性最为丰富的属之一，分布广泛、种类众多、株型叶型丰富、花色叶色多样。秋海棠属大部分为野生种，经引种育种后能成为良好的观赏材料，深受世界人民喜爱。

瓦氏秋海棠(BegoniawallichianaL.)生物量大、花果量大、生命力顽强、繁殖周期短、可多茬收获、再生能力强，十分适宜进行遗传转化试验。同时，鉴于其具有一定的观赏价值，本试验拟从高效再生和遗传转化两方面进行研究。

建立适用于瓦氏秋海棠的相应技术体系，并尝试与转基因模式植物烟草进行比较，探讨瓦氏秋海棠作为观赏植物遗传转化模式植物的可能性。叶盘法是遗传转化的常用方法，通常使用叶片作为外植体，切除伤口后将其浸泡于混合均匀的农杆菌侵染液中进行侵染。

农杆菌为一种革兰氏阴性菌，对双子叶植物伤口处产生的酚类物质具有趋化性，能够从伤口处侵入植物体内并与植物基因组DNA进行整合，其整合效率与植物自身情况、外界环境和操作流程密切相关，良好的高效再生体系是进行遗传转化试验的基础。

因此，建立一个适合瓦氏秋海棠叶片的高效再生体系，是进行高效遗传转化实验的基础。通过组织培养是进行叶片高效再生的最佳手段，植物高效再生的基础是细胞的全能性，主要涉及脱分化、再分化两个过程，其中植物生长调节剂起了关键作用，合适的激素浓度和配比能大大加快外植体脱分化与再分化的进程，同时能最大程度上保证再生植株的遗传稳定性。

秋海棠属植物的分类、生物学特性及资源分布

秋海棠属种类繁多，是植物界第6大属，世界维管束植物第5大属，已知其属下有超过1900种叫。秋海棠属内多数为野生种，株形优美、叶形奇特、叶色及斑纹丰富、花色艳丽、果实形态多样，甚至在同一种类中也存在有不同的花色叶色等，目前已知超过15000种，是世界上多性最丰富的植物类群之一。

该属植物大部分喜暖湿，不耐寒，喜荫蔽，惧怕阳光直射，故多生长于林下、悬崖石壁、山谷溪流、洞穴等地，只有少数种类耐湿或者耐干旱。野生品种多分布于热带及亚热带地区，其中以非洲、中南美洲、亚洲居多，为世界秋海棠属植物的主要分布中心，分别约有160、800、900种。

秋海棠在非洲及东南美洲主要分布于1000m以上的高海拔地区，亚洲则主要分布于东亚、南亚及中国部分地区。中国拥有十分丰富的野生秋海棠种质资源，分布范围十分广泛，但多分布于华南、西南等山地林区，尤其是在广西、贵州、四川、云南、西藏等地都发现了十分丰富的秋海棠资源，并不断有新种被发现。

中国秋海棠属资源分布海拔可从最低约50m到最高约3500m，分布海落差。集中分布于海拔700-2000m山地，为典型的亚热带区系类型。同一种秋海棠在不同海拔高度的分布也十分广泛，如四川峨眉山地区的掌裂叶秋海棠(B.pedatifida)可从海拔550m一直分布到1740m，网脉秋海棠(Bwilsoni)则可从600m分布到1800m。

秋海棠属植物极易发生自然杂交，且杂交频率高，各杂交品种也极大丰富了秋海棠属的多样性。其中，通过引种栽培并通过杂交选育的许多优良品种如四季秋海棠、丽格秋海棠等已成为重要花坛花卉,也是世界广为栽培的著名园艺品种。我国秋海棠属的栽培品种多达上千种,在对中国秋海棠属植物进行资源调查后发现，有超过50%的秋海棠品种具有园艺观赏价值。

秋海棠属植物离体再生的研究进展

秋海棠主要通过播种、扦插、分株等方式繁殖。在对秋海棠栽培基质和栽培生境的选择方面，前人已有了较多的研究。秋海棠种子极其细小，播种后无需覆土即可生长，基质需要有良好的透气性和保水性，使用珍珠岩、石按等比例混合，种子出苗率可在90%以上。

杨丽华探究了温度对不同秋海棠种子萌发的影响之后发现，恒温较变温表现出了更好的萌发特性。除播种繁殖外，扦插也是秋海棠生产上常用的繁殖方式之一。有研究表明将脱脂棉平铺于培养M中并用无菌水浸湿，然后将叶片置于其上，在23-25C30001x光照强度下，不同品种的观叶秋海棠均有较高的生根率。

在对濒危物种古林等秋海棠进行扦插繁殖研究后发现，以带柄叶片作为插穗，使用珍珠岩作为扦插基质进行扦插,并于扦插前使用100mg/L蔡乙酸处理插穗切口遮光70%-75%进行处理是最佳方案组合。

由于秋海棠繁殖能力强，极易成活，在秋海棠的引种过程中，成果率较高。在栽培养护过程中，诸如温度、湿度、光照等自然环境条件及浇水量、施肥量和栽培基质等人为环境调条件的相互配合是秋海棠成活的根本，同时，夏季进行降温处理是秋海棠成功越夏的关键。

比起播种、扦插、分株等方式，组织培养是秋海棠繁殖中常常使用的一种更加快速、高效、稳定的繁殖方式，是对植株进行短期内扩繁和遗传转化实验的最佳方式。国内外对于秋海棠的组培繁殖也有较多的研究，并已经在枫叶秋海棠突脉秋海棠、蟆叶秋海棠等多种品种中取得了成功。

对于秋海棠组织培养的研究多集中在外植体的选择、消毒方法和消毒时间的确定、基本培养基及生长调节剂的选择等方面。秋海棠再生能力较强，叶片、茎段乃至花丝、花药等器官均可作为外植体进行离体培养，其中叶片及叶柄作为外植体的应用最为广泛。

在蟆叶秋海棠的组织培养研究中发现，相较于叶柄，叶片作为外植体能够诱导出更多的不定芽，不定芽生长迅速，尤其以靠近叶缘部位或叶柄基部、叶龄在1-2个月的叶片为最佳；叶柄的污染率较低，并能形成更多的愈伤组织，但后期大多停止生长。

在对球根秋海棠的研究中也发现，使用叶片作为外植体污染率仅为15%，同时分化率也相对较高，可达到80%，而以球茎作为外植体则污染率较高。将金正日花的叶尖、叶中部、叶基部和叶柄接种比较后发现，叶基部诱导与分化能力远远大于叶中部和叶尖部。

使用枫叶秋海棠的叶片、叶柄作为外植体，发现培养20d左右的叶片就能诱导出不定芽;培养30d左右的叶柄则先在两端诱导出不定芽然后逐渐发展至整个叶柄，但叶柄诱导出的不定芽分化及生长速度慢，且再生频率较低。

而在对掌叶秋海棠的研究中发现，以叶柄、叶片和茎段作为外植体进行常规消毒后污染率高、存活率较低，推测其原因可能是因为叶片较薄，其上附着有大量的表皮毛，导致常规的消毒操作无法达到应有的效果，相比之下，采用尚未完全成形的不定芽作外植体的能够取得较好的消毒效果和较高的存活率。

瓦氏秋海棠与烟草再生过程的比较分析

烟草是被世界广泛认可和种植的经济作物，也是遗传学、分子生物学及细胞生物学的重要模式植物，具有生长周期短、再生效率高等优点。相较于烟草，瓦氏秋海棠种子发芽时间较迟，发芽率较低，外植体的不定芽诱导率也较低。

但瓦氏秋海棠体量大，离体培养时，每个外植体能诱导产生大量的不定芽，其数量可数倍高于烟草，且大部分不定芽都能形成完整植株，植株存活能力较强。同时，瓦氏秋海棠为半木本植株，主茎木质化程度较高，枝干分裂较多，相较于一年生的草本植物烟草，瓦氏秋海棠能够做到四季开花、多茬收获。

其种子仅有拟南芥种子大小的二分之一，种子数量更是烟草的数倍，单个果荚即能播种上百粒，发芽及生长都很快。因此可以认为，瓦氏秋海棠上述两方面的特点对于提高观赏植物的遗传转化效率、研究转基因植株的生物学功能具有重要的意义，是潜在的适用于观赏植物遗传转化的优良模式植物。

抑菌剂（Cef）浓度对瓦氏秋海棠叶片再生的影响

Cef有抑菌作用，外植体侵染后进行恢复培养时，常在培养基中加入一定浓度的Cef，以抑制农杆菌污染，但在农杆菌侵染过程中，Cef浓度与抑菌效果之间的关系未知，同时，Cef浓度对瓦氏秋海棠叶片再生的影响同样未知。

本试验将外植体浸入OD600为0.5的农菌液中侵染30min，随后接种至添加有不同浓度Cef的培养基上，20d后观察其污染率。结合Cef对叶片不定芽诱导的效果探究并确定Cef的最佳添加浓度。

瓦氏秋海棠与烟草PCR结果比较

瓦氏秋海棠与烟草在再生速度及再生效率方面有较为一致的特性，均能在短时间内由叶片再生出不定芽、耐农杆菌污染、生命力强，这些特性是决定叶盘法遗传转化效率的关键因素之一。

对瓦氏秋海棠与烟草同时进行试验后，烟草亦使用OD600分别为0.515的侵染液侵染1h并共培养2d，接种于添加有300mg/LCef、5g/LHyg的再生培养基，从筛选培养4月后获得的10余株无菌植株中，其GFP基因的PCR检测率为75-87.5%。

与此相比，对已在50mg/LHyg培养基上培养7d的瓦氏秋海棠转化材料进行GFP基因的PCR检测，结果在抗性生植株中GFP基因的最终检测率为50%，其PCR检测率似乎相对较低。但是，在转化材料的筛选阶段，瓦氏秋海棠筛选强度较高，为50g/LHyg。

而烟草相对较低，仅为5mg/LHyg;并且，瓦氏秋海棠抗性植株中，确定已经导入了GFP基因的比例为16.7%，而烟草并不能完全排除农杆菌污染的可能性，由此说明瓦氏秋海棠转基因植株的检测与鉴定技术也适用于烟草。

结论

春化10d是最为理想的春化时间;消毒方法对种子也具有一定的影响，先使用0.1%高酸溶液处理1min，再使用10%次氯酸钠溶液处理10min能使种子保持有较高的发率;相较于1/2MS培养基，MS培养基上种子发芽尽管较慢，但种子生长活力较好。

(2)使用15mg/L的6-BA和02mg/L的NAA素配比对瓦氏海棠离体叶片的高效再生具有良好效果:添加2,4-D对外植体生长显示出不良影响，外植体在MS基本培养基生长情况较好。

(3)瓦氏秋海棠离体叶片通常在主叶脉处分化形成不定芽，进行遗传转化时应切取包含主叶脉的外植体。

侵染后的外植体在后续各个培养期都容易发生农杆菌污染，根据外植体生长情况，合理选用100-300mg/L的抑菌剂(Cef)能够有效抑制农杆菌的生长;筛选培养过程中，筛选剂(Hyg)的浓度不能低于5mg/L否则无法达到筛选效果。

(4)瓦氏秋海棠生命力强，侵染1-2h,并摇动菌液能达到最佳的转化效果:菌液浓度对转化效果没有太大的影响，但浓度过高时会导致后续容易出现污染抑菌困难;共培养时间以2d为宜:共培养完成的外植体可以进行恢复培养或用5mg/LHyg直接筛选培养。但直接筛选培养所需生长时间较长，与此相比，先恢复培养一段时间再进行Hyg梯度筛选的效率较高。

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