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农杆菌介导的小麦愈伤组织遗传转化及再生体系研究

来源：花匠小妙招时间：2024-09-07 15:24

农杆菌介导的小麦愈伤组织遗传转化及再生体系研究

【摘要】： 小麦是人类赖以生存的主要粮食作物之一,其产量直接关系到人类的生存与发展并在整个国民经济中占有重要地位。盐害胁迫严重影响小麦产量和品质,采用常规育种方法提高小麦耐盐性,获得抗盐性强的新品种十分困难。随着分子生物学的发展,利用植物基因工程技术进行小麦遗传改良是遗传育种的新方向,在未来农业生产中前景广阔。相对于二倍体的水稻和玉米面言,异源六倍体小麦(2n=6x=42)基因组巨大,组织培养困难、突破较晚,转基因研究起步晚,农杆菌转化条件更为复杂和严格,小麦转基因育种进程明显落后于其他作物。转录因子是一类能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件相结合,调控相关基因时空表达的蛋白质因子。研究表明,植物锌指蛋白类转录因子在抗旱、抗冻及抗盐胁迫中发挥重要作用。本研究所用锌指蛋白基因(TaCHP)来源于本实验室建立的小麦/长穗偃麦草体细胞杂交渐渗新品种山融3号(SR3)。该品系是通过不对称体细胞杂交,将长穗偃麦草(Agropyron elongatum2n=70)的染色体小片段或/和DNA渐渗入普通小麦济南177(JN177)基因组得到的。在拟南芥的前期研究中发现,生长在含100和150mM NaCl培养基上的转TaCHP基因拟南芥的叶片和根系都好于野生型对照。本研究将抗盐相关TaCHP基因导入小麦幼胚来源的愈伤组织,获得了转基因再生植株。对转基因植株进行了分子生物学与表型鉴定分析；对农杆菌介导的小麦愈伤组织转化体系的相关参数进行了优化,完善了转化流程,对实验室组培条件下,转基因再生植株的移栽进行了初步探索。主要研究成果如下：1、将构建于pGA3626载体上的锌指蛋白TaCHP基因导入幼胚来源的小麦核生3号、杨麦15、矮抗58胚性愈伤组织,获得21个转基因阳性株系,经PCR扩增、Southern Blot杂交验证与抗盐及抗除草剂表型鉴定证明,目的基因稳定存于T1转基因植株基因组中,现已收获T1代种子2、采用农杆菌介导法将重组质粒pGA3626-TaCHP(含Bar筛选基因和GUS报告基因)上携带的小麦抗盐相关TaCHP基因导入核生3号小麦愈伤组织受体,对影响转化率的主要因素进行了优化：①转化前在超净台吹干处理愈伤组织30min,可使GUS阳性检测率提高到25.39%；②25℃的共培养温度能同时保持愈伤组织与农杆菌活性；③共培养后用MS液体培养基洗涤转化的愈伤组织1-2次,然后无菌滤纸吸干并转移到含有Timentin(160mg/l)的恢复筛选培养基上既利于转化率的提高又能有效抑制农杆菌生长。3、结合水培炼苗与空气炼苗的优点,创立了新的再生植株移栽、培养方法,使再生植株成活率达到80%以上

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012

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