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最新研究 | 快速精准破解丝状真菌鉴定难题！

来源：花匠小妙招时间：2024-11-23 10:39

近日，四川大学华西医院检验科团队在BMC Microbiology上发表的题目为“Formic acid sandwich method is well-suited for filamentous fungi identification and improves turn around time using Zybio EXS2600 mass spectrometry”的文章。

文章指出，使用全自动微生物质谱检测系统EXS2600进行快速丝状真菌鉴定（采用甲酸夹心法进行前处理），属级鉴定准确率达97.29%，种级鉴定准确率达92.79%。使用微生物质谱检测系统EXS2600鉴定丝状真菌大大缩短了样本周转时间，从5-10天缩短到2-5天。

研究内容

该研究从四川大学华西医院检验医学科（2019年1月至2023年11月）的真菌感染患者中分离出临床丝状真菌菌株共117株（表1），包括曲霉、小克银汉霉、外瓶霉、镰刀菌、横梗霉、毛霉、根霉、赛多孢菌、孢子丝菌、篮状菌、木霉、毛癣菌等。所有菌株均在-80℃条件下保存后经过28℃孵育2- 5天，实验菌株均进行测序作为参比方法，用于评估EXS2600质谱检测系统鉴定准确性。

表1 Zybio EXS2600鉴定临床丝状真菌的种类

采用EXS2600质谱系统评价两种快速前处理方法（图1）对丝状真菌鉴定的性能，并比较使用EXS2600质谱系统前后TAT的变化。

图1 两种前处方法的说明：A Zybio丝状真菌分散法试剂盒；B甲酸夹心法

研究结果

丝状真菌的总正确识别率（种、属或复合体/群水平）高，其中采用甲酸夹心法总体正确率为95.73%（112/117），分散法总体正确率为94.02%（110/117）。除去因为数据库未收录的6株菌，甲酸夹心法的属正确率为97.29%（108/111），种正确率为92.79%（103/111）；分散法的属级鉴定准确率分别为96.39%（107/111），种级鉴定准确率为91.89%（102/111）。

同时，两种方法对曲霉、横梗霉、根霉、毛霉和篮状菌的识别正确率均为100%，并能在镰刀菌中区分轮状镰刀菌和层生镰刀菌。值得注意的是，对不常见真菌（如粉红单端孢菌和白地霉）的种水平鉴定具有很高的正确率。

该研究还指出了EXS2600鉴定丝状真菌准确性较高的原因：

一方面，EXS2600的数据库兼容了同一菌株的差异性，谱图是不同生长时期下、并采用不同的前处理方法采集的。

另一方面，某些真菌在质谱中通常表现出不理想的峰图，当数据库中包含谱图质量较差或特征峰数量较低的指纹图谱时，容易导致假阳性结果。为了提高真菌识别的准确性，EXS2600数据库分为普通临床数据库和真菌数据库。在临床数据库中保留了临床上常见的、谱图质量较高、不易混淆的真菌谱图，而真菌数据库存储的真菌种类更广泛，能最大限度地提高不常见真菌的检出率。

此外，在今年简阳市人民医院开展的临床疑难丝状真菌盲测比对项目中，EXS质谱平台也有不俗的表现。盲测样本是由四川省人民医院提供的已完成基因测序的98株疑难真菌，涵盖了曲霉、毛霉、青霉、镰刀菌、枝孢霉和小孢子菌等。

全自动微生物质谱仪EXS3000采用甲酸夹心法、分散法、甲酸乙腈提取法三种前处理方法对98株疑难真菌进行了分析，并探讨了不同前处理方法对不同丝状真菌的鉴定效果，以寻求最适合的前处理方式，提高鉴定准确性。

结果数据显示，采用甲酸夹心法进行预处理的方法对丝状真菌的鉴定的总体效果最好，鉴定率为85.71%，其他方法次之，尤其是对曲霉和青霉鉴定，其鉴定率分别为94.74%和83.33%。但对枝孢霉鉴定效果最好的前处理方法是中元汇吉的分散法试剂盒，其鉴定率为88.24%。三种前处理方法对毛霉和互隔链格孢的鉴定率均为100.00%。

微生物质谱对丝状真菌的鉴定相对于细菌、酵母的鉴定存在着检出率低、重复性差、分辨率低等挑战。这主要是由于丝状真菌细胞壁的复杂性导致蛋白质释放相对困难，使得前处理工作更加具有挑战性。此外，丝状真菌在生长的不同阶段，细胞壁的组成也会发生变化。

在早期生长阶段，细胞壁主要由几丁质层和蛋白质层构成，而在成熟期，细胞壁则包含了几丁质层、蛋白质层、葡聚糖蛋白层和质层蛋白质层。虽然在生长的不同阶段，核糖体蛋白组成并没有发生变化，但包括细胞壁蛋白在内的其他蛋白质可能会发生质和量的变化，从而体现出谱图的差异性。

因此选择最适合的质谱鉴定前处理方式，以及丰富准确的数据库能够更大程度提高丝状真菌的检出率，相信在临床疑难菌鉴定领域，尤其是丝状真菌检测，MALDI-TOF MS会成为更多临床微生物实验室检测的有力工具。

参考文献：

[1] Wu C, Ao K, Zheng Y, Jin Y, Liu Y, Chen Z, Li D. Formic acid sandwich method is well-suited for filamentous fungi identification and improves turn around time using Zybio EXS2600 mass spectrometry. BMC Microbiol. 2024 Jul 3;24(1):238.

[2] Jiang X, Xiao D, Yu H, Sun A, Liu Q, Liu T. Evaluation of pretreatment methods for filamentous fungal detection. Sci Rep. 2024 May 13;14(1):10899.

编辑：唐强虎审校：方琪