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一种基于病原真菌孢子形态快速鉴定植物真菌病害的方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-11-18 03:52

本发明涉及一种基于病原真菌孢子形态快速鉴定植物真菌病害的方法，适用于快速鉴定或初步诊断植物病部产生真菌孢子的常见真菌病害，属于植物保护领域。

背景技术：

植物病害的爆发和流行往往导致其产量损失和品质下降，最终影响经济效益。对植物病害及时准确的诊断，是采取合适措施、开展有效防控工作的前提。通常采用柯赫氏法则对植物侵染性病害进行诊断，即对植物病部的病原物进行分离培养，随即接种至相同品种的健康植株上，观察其是否表现出相同的病害症状；再对此病部病原菌进行分离鉴定，最终确定病原物种类。

在实际生产中，针对常见的植物真菌病害，目前常用的检测方法可分为两类：一类是基于图像检测与模式识别技术，通过检测植物病害图像进行病害诊断。此类技术操作简便，但由于田间病害症状往往比较复杂，导致植物病害检测的准确性较低。另一类则是使用形态学及分子生物学检测手段，通过对病原物进行鉴定，最终确定病害种类。此类方法检测效率和准确性较高，但由于需要对病部组织上的病原物进行分离培养，容易出现杂菌污染、培养方式不当等问题。不仅检测周期较长，还可能由于分离失败而影响检测结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何快速鉴定常见的植物真菌病害。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于病原真菌孢子形态快速鉴定植物真菌病害的方法。

本发明提供的基于病原真菌孢子形态快速鉴定植物真菌病害的方法包括如下步骤：

1)用涂有凡士林的载玻片粘取植物病部组织，以获取所述植物病部组织表面的病原真菌孢子；

2)镜检所述植物病部组织表面的病原真菌孢子的形态学特征，确定其真菌种类，并结合植物病状特征鉴定植物真菌病害种类。

上述方法中，所述1)中，所述植物病部组织具有植物真菌病害典型症状；

进一步的，所述植物真菌病害典型症状可为如下至少一种：霉状物、粉状物、点状物、锈状物和丝状物。

上述方法中，所述1)中，所述涂有凡士林的载玻片的制备方法如下：将凡士林均匀涂抹于载玻片的一面。

进一步的，将凡士林均匀刮涂于载玻片的一面，且尽量薄，避免涂抹过厚。

更进一步的，所述凡士林为白凡士林。所述白凡士林具体为国药集团的产品，cas编号：8009-03-8，产品编号：69047662。

所述载玻片为单头单面磨砂，其规格具体为26mm×76mm，型号具体为cat.7105p。

在本发明的具体实施例中，所述涂有凡士林的载玻片的制备方法如下：用钢尺刮取适量(0.01g)的白凡士林，沿载玻片表面由左向右轻轻刮涂，涂成均匀薄层，置于样品盒内待用。

上述方法中，所述1)中，所述用涂有凡士林的载玻片粘取植物病部组织的方法为将涂有凡士林的载玻片直接贴抹于植物病部组织上。在实际应用中，也可以取下含有病部组织(如病斑)的植物叶片，然后将所述植物叶片上的病部组织(如病斑)贴抹于涂有凡士林的载玻片的取样区内。

进一步的，所述贴抹的方法如下：用载玻片上涂有凡士林的一面在植物病部组织上来回涂抹数次。也可以将所述植物叶片上的病部组织(如病斑)在涂有凡士林的载玻片的取样区内来回涂抹数次。

所述贴抹时应选取典型症状的明显病征，如霉层、点状物、锈状物等，可拍照记录病状特征(如病斑特征)。

更进一步的，所述涂抹数次可为2-3次。

上述方法中，所述1)包括如下步骤：在田间找到具有植物真菌病害典型症状的植物病部组织(如病斑)，仔细观察其表面或背部的病征(如霉层或其它病征等)，用载玻片涂有凡士林的一面直接贴抹于病部组织(如霉层或其它病征等)上，来回涂抹2-3次，得到收集有病原真菌孢子的载玻片；将所述收集有病原真菌孢子的载玻片置于样品盒中，并记录样品编号及病状特征。该步骤可在田间直接操作。

上述方法中，所述2)中，所述镜检还包括如下步骤：在收集有病原真菌孢子的载玻片的取样区内加适量灭菌水，然后盖上盖玻片。

所述盖玻片应盖住所述载玻片上的取样区。在本发明的具体实施例中，所述盖玻片规格具体为20mm×20mm。

所述镜检的显微镜能满足常规的真菌孢子形态特征的观察即可，如光学显微镜。在观察真菌孢子的形态特征时，一般物镜放大倍数可为4倍、10倍、20倍、40倍。

上述方法中，所述2)包括如下步骤：根据所述病原真菌孢子的形态特征，确定所述病原真菌的种类，若所述病原真菌所引发的植物病害症状与实际植物病害症状吻合(一致)，则该植物真菌病害为由所述病原真菌引发的病害，进而确定植物真菌病害的种类。

根据所述病原真菌孢子的形态特征，确定该病原真菌的种类的方法如下：根据所述病原真菌孢子的形态特征，结合《真菌鉴定手册》、《植物病原真菌学》等工具书对收集到的病原真菌孢子进行鉴定。

确定所述病原真菌所引发的植物病害症状的方法如下：通过查找《中国农作物病虫害》、《中国粮食作物、经济作物、药用植物病虫原色图鉴》、《蔬菜病虫害防治彩色图鉴》等工具书确定所述病原真菌所引发的植物病害症状。

上述方法中，所述2)中，当镜检结果中出现不止一种病原真菌孢子时，则将出现的每一种病原真菌孢子进行一一鉴定，并结合植物病害症状，综合分析植物真菌病害种类。

上述方法中，所述1)和所述2)之间还包括将收集有病原真菌孢子的载玻片运至实验室的步骤；所述运送的方法包括如下步骤：将收集有病原真菌孢子的载玻片置于样品盒中，然后再将所述样品盒运至实验室。若无法及时运至实验室时，则需将所述样品盒置于低温保存箱中保存，以降低孢子萌发速度。

上述方法中，所述植物真菌病害为植物病部能产生大量真菌孢子(病部有明显病征)的常见真菌病害，如水稻稻瘟病、水稻胡麻叶斑病、玉米大斑病和马唐草瘟病等真菌病害。

所述植物真菌病害可为单一真菌侵染产生的病害，也可多种真菌复合侵染产生的病害。

本发明通过直接快速收集植物病部真菌孢子，根据其形态学特征初步鉴定病部真菌种类，从而对无法确诊的植物真菌病害进行快速地鉴定。相较于采集植物病部组织至实验室保湿培养得到病原物孢子的传统方法，本发明在田间即可直接获得大量的病原真菌孢子，操作简便快捷，省时省力。同时本发明对所采集的新鲜病部的孢子直接进行形态学观察和鉴定，避免了后期培养可能出现的杂菌污染、培养条件不宜等问题，检测方法简便高效，可靠性强。本发明的真菌病害快速判断方法是基于植物病部能产生具有形态学特征的真菌孢子，将形态学鉴定方法结合已知的典型植物病状特征对病害种类进行判断，适用于常见的、有典型症状的植物真菌病害进行快速鉴定，以便及时采取有效措施防止病害蔓延，避免造成更严重的经济损失。

附图说明

图1为在田间收集植物病斑上真菌病原物的过程。图示说明：a图，在取样载玻片上编号、涂抹凡士林；b图，贴抹植物病斑，收集真菌孢子；c图，样品置于样品盒内，待检测；d图，在光学显微镜下镜检植物病部的真菌孢子。

图2为在田间水稻、玉米、马唐叶片上常见的真菌病害病斑。图示说明：a图，田间水稻上疑似叶瘟病病斑；b图，田间水稻上疑似胡麻叶斑病病斑；c图，田间玉米上疑似玉米大斑病病斑；d图，田间杂草马唐上疑似草瘟病病斑。

图3为在显微镜下镜检植物病原物特征。a图，水稻叶瘟病斑上的稻瘟菌分生孢子；b图，水稻胡麻叶斑病原菌平脐蠕孢分生孢子；c图，玉米大斑病原菌凸脐蠕孢分生孢子；d图，马唐草瘟病草瘟菌分生孢子。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明提供的基于真菌病原物分生孢子形态快速鉴定植物真菌病害的方法，包括以下步骤：

步骤一、快速地收集植物病部真菌孢子。针对田间植物真菌病害的典型病状，利用涂有凡士林的载玻片，粘取病部真菌的孢子(或其它病征)，取样后置于样品盒内运回实验室，备检。

步骤二、镜检植物病部真菌孢子的形态学特征，明确病部真菌种类，结合病状特征，对该种真菌病害进行快速鉴定。

具体步骤如下：

1、将取样所用载玻片编号，用钢尺刮取适量白凡士林，沿载玻片表面由左向右轻轻刮涂成均匀薄层，置于样品盒内待用(图1-a)。

2、在田间找到具有植物真菌病害典型症状的病部组织，仔细观察其表面或背部的病征(如霉层或其它病征)，如有必要可拍照记录发病情况。将取样载玻片直接贴抹于植物病组织上，或将叶片上病斑取下贴抹于取样载玻片的取样区内，可适当来回涂抹(图1-b)。将收集有病部真菌孢子的载玻片样品置于样品盒内，记录样品编号及对应病部特征(图1-c)。

3、在实验室取出待检样品，在每个取样区内分别加适量灭菌水，盖上盖玻片，在光学显微镜下镜检样品中病部真菌孢子的形态特征(图1-d)。根据《真菌鉴定手册》、《植物病原真菌学》等工具书鉴定真菌种类，根据《中国农作物病虫害》、《中国粮食作物、经济作物、药用植物病虫原色图鉴》和《蔬菜病虫害防治彩色图鉴》等工具书查找符合该种真菌病害病状的病原菌特征，对植物真菌病害进行快速鉴定或初步诊断。

以下实施例分别为田间疑似水稻稻瘟病、玉米大斑病的快速鉴定，以及水稻、马唐叶部病斑的初步诊断。

实施例1、水稻稻瘟病的快速诊断方法

一、水稻稻瘟病的症状

稻瘟病在水稻整个生育期均能发生，根据水稻发生部位的不同，可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等。其中叶瘟病斑可分为慢性型、急性型、白点型、褐点型等4种类型。慢性型水稻稻瘟病的病斑常呈梭形斑，中央灰白色，边缘褐色，外有淡黄色晕圈，有延伸的褐色坏死线。叶背有灰色霉层，病斑较多时连片形成不规则大斑(图2-a)。

二、水稻稻瘟病的快速诊断

在田间将水稻叶片病斑背部霉层贴抹于取样载玻片上，在显微镜下镜检，可看到大量的灰色、具有2个隔膜的梨形孢子(图3-a)。参照《植物病原真菌学》、《中国农作物病虫害》进行鉴定。鉴定结果表明：该病原真菌为稻梨孢菌(magnaportheoryzae)。

稻梨孢菌引发的水稻稻瘟病的症状如步骤一所述，且水稻叶片在田间的实际病害症状与步骤一中症状相符，则该病害可初步确诊为水稻稻瘟病。

三、柯赫氏法则验证

在实验室从步骤二中的发病水稻叶片的发病组织中对病原菌株进行分离培养，并接种于普感品种(丽江新团黑谷)水稻叶片上。接种方法可参照文献《离体水稻叶片划伤接种鉴定稻瘟菌的致病型》(张海旺，2014)中的方法进行。

结果表明：接种该病原菌株的水稻可见典型的稻瘟病病害特征，且该病斑上产生大量稻梨孢菌分生孢子。由此可确诊该病害为水稻稻瘟病。与本发明的诊断结果一致。

实施例2、水稻胡麻叶斑病的快速诊断方法

一、水稻胡麻叶斑病的症状

水稻胡麻叶斑病在水稻整个生育期均可发病，且稻株地上部均可受害。叶片发病最为普遍，多呈如芝麻粒大小的椭圆斑，病斑中央灰褐色至灰白色，边缘褐色，周围有深浅不同的黄色晕圈，严重时连成不规则大斑(图2-b)。

二、水稻胡麻叶斑病的快速诊断方法

在田间将叶片病斑中央贴抹于取样载玻片上，在显微镜下镜检，可看到分生孢子呈暗褐色，舟形、倒棍棒状或近圆柱形，端部较尖，脐部较平滑略突出，孢子略弯，具5-10个(多为6个)假隔膜(图3-b)。参照《植物病原真菌学》、《中国农作物病虫害》进行鉴定。鉴定结果表明：该病原真菌为稻平脐蠕孢(bipolarisoryzae)。

稻平脐蠕孢引发的水稻胡麻叶斑病的症状如步骤一所述，且水稻叶片在田间的实际病害症状与步骤一中症状相符，则该病害可初步确诊为水稻胡麻叶斑病。

实施例3、玉米大斑病的快速诊断方法

一、玉米大斑病的症状

玉米叶部常见病害有玉米大斑病、玉米小斑病，玉米链格孢菌叶枯病等，均可扩展至椭圆形病斑，潮湿时会产生灰黑色霉层，为病害诊断造成干扰。玉米大斑病的叶部病斑呈梭型或椭圆形、中央淡褐色，外缘暗褐色，当田间湿润度大时，病斑表面产生灰黑色霉状物(图2-c)。

二、玉米大斑病的快速诊断方法

在田间将玉米叶部病斑中央霉层贴抹于取样载玻片上，在显微镜下镜检，可看到大量分生孢子呈淡黄褐色，梭形或窄纺锤形，具有2-7个假隔膜(图3-c)。参照《植物病原真菌学》、《中国农作物病虫害》进行鉴定。鉴定结果表明：该病原真菌为大斑病凸脐蠕孢(exserohilumturcicum)。

大斑病凸脐蠕孢引发的玉米大斑病的症状如步骤一所述，且玉米叶片在田间的实际病害症状与步骤一中症状相符，则该病害可初步确诊为玉米大斑病。

实施例4、马唐草瘟病的快速诊断方法

一、马唐草瘟病的症状

马唐是稻田常见的杂草之一，其叶部病斑呈椭圆形或梭形，病斑中央灰白色，边缘有褐色或紫红色晕圈，叶背可见灰色霉层(图2-d)。

二、马唐草瘟病的快速诊断方法

在田间将叶片病斑背部霉层贴抹于取样载玻片上，在显微镜下镜检，可看到大量的灰色、具有2个隔膜的梨形孢子(图3-d)。参照《植物病原真菌学》、《中国粮食作物、经济作物、药用植物病虫原色图鉴》进行鉴定。鉴定结果表明：该病原真菌为梨孢属真菌(magnaporthegrisea)。