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植物组织培养脱毒技术综述

来源：花匠小妙招时间：2024-11-07 23:58

技术研究植物组织培养脱毒技术综述沈阳农业大学生物科学技术学院生物技术专业李美娜摘要植物病毒分布广、危害大,对农业和花卉产业的发展产生了巨大的冲击。国内外的系统研究和生产实践证明培育和栽培无病毒种苗是防治作物病毒病的根本措施。本文通过查阅国内外研究文献和资料,综合阐述了热处理脱毒法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法等方法以及几种常用的病毒检测方法。关键词植物组织培养脱毒技术检测技术植物病毒分布广、危害大,对农业和花卉产业的发展产生了巨大的冲击。近年来,随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术,病毒病开始流行,严重影响了中国花卉产业的发展。目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。世界上不少国家十分重视这项工作把脱除病毒纳入常规良种繁殖的一个重要程序建立了大规模的无病毒苗生产基地为生产提供无病毒良种种苗已经在生产上发挥了重要作用取得了显著的经济效益。无病毒良种种苗的优点有1产量提高。通过脱毒可大大提高作物的产量如草莓脱毒可提高产量20%—30%、马铃薯脱毒可提高产量40%以上、地瓜脱毒可提高产量30%—50%、苹果脱毒可提高产量15%—45%。2品质提高。脱毒后的植物所结果实品质提高如地瓜脱毒可提高出干率0〃1%—1〃5%苹果着色好糖度高观赏植物生长健壮、花大、花艳优质花增加商品价值提高。3抗病性增强。脱毒后植物本身抗性提高。对病虫的抗性增强如地瓜脱毒后可增强抗茎线虫病另外脱毒时还会同时脱除有些细菌、真菌、线虫等。一、脱毒技术当前脱除植物病毒的方法有热处理脱毒法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法3类。其中组织培养脱毒法又包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒法、珠心组织培养脱毒法3种方法。1〃茎尖培养脱毒。1茎尖培养脱毒原理。在染病毒植株体内,病毒分布并不均匀,在生长点病毒含量最低。病毒通过维管束和胞间连丝传播,在分生区内无维管束,病毒扩散慢,加之植物细胞不断分裂增生,所以病毒含量少,在茎尖生长点几乎检测不出病毒,因此切取茎尖愈小愈好,但实际操作中茎尖取太小不易培养成活,过大又不能去毒。2茎尖培养的方法及注意事项。将消毒后的材料放置在20~40倍解剖显微镜下,用解剖刀剥取0〃1~1mm的茎尖,迅速放入培养基中,如果在空气中暴露时间过长,就会因失水引起茎尖死亡。赵军良等人的研究表明,带有一个叶原基的茎尖,脱毒效果最好,成活率最高。不同的植物材料茎尖剥取的方法和最适合脱毒的茎尖大小不同。在菊花的茎尖培养中,在超净工作台内将消毒后的茎尖中用肉眼能看到的叶柄切除,在实体解剖镜下用解剖刀剥离顶芽至露出带有1~2片叶原基的生长点,生长点大小约在0〃3~0〃5mm左右,大于以上尺寸脱毒率将会下降,反之成活率将会下降,迅速将摘出的生长点置于培养基中。2〃愈伤组织脱毒。愈伤组织脱毒的原理是愈伤组织的某些细胞不带病毒,这是由于病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度,或者是有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。方法是通过花卉各种器官或组织诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再诱导分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗。这种方法的缺陷是植株遗传性不稳定,可能会产生变异植株,并且一些植物的愈伤组织尚不能产生再生植株。3〃热处理脱毒。热处理的原理是病毒由蛋白质组成,高温可以使蛋白质变性,所以通过高温钝化病毒。热处理的材料可以是母株已长芽的块茎,也可以是已经剥离的已长到1cm左右的小植株。高温热处理是在恒温箱内进行,将籽球或小苗放入恒温箱中,起点温度可稍低些,逐渐升至处理温度,一般在35~54℃条件下热处理几小时、几天甚至几个月。热处理通常与茎尖培养相结合脱毒,对于单用茎尖或热疗法难以脱除的病毒,可先进行热力处理,使植株茎尖无毒化,再采用茎尖组织培养法,这样可以提高脱毒成功的几率。在热处理茎尖的过程中,通常温度越高、时间越长、脱毒效果就越好,但是同时植物的生存率却呈下降趋势,所以温度选择应当考虑脱毒效果和植物耐性2个方面。洪霓等在梨病毒的脱毒研究中采用2种处理,一为恒温处理,温度控制在37±1℃;二为变温处理,温度为32℃和38℃每隔8h变换1次,发现变温处理比恒温处理植株死亡率低,脱毒效率高。热处理的缺陷是不能脱除所有病毒。例如在侵染马铃薯的病毒之中,对于PLRV、PVA和PVY不进行高温预处理,脱毒率也相当高,而高温预处理却可以显著提高对PAMV、PVX和PVS的去除。一般而言,对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效,对杆状和线状病毒的作用不大。4〃微体嫁接脱毒法。把小于0〃2mm的茎尖作为接穗嫁接到实生苗砧木种子实生苗不带毒连同砧木一起在培养基上培养。成功例子柑橘、苹果。培养要求剥离茎尖技术较难接穗取材的季节等。5〃珠心组织脱毒法。有人认为病毒通过维管组织传播珠心组织与维管组织没有直接联系故可以脱毒。成功例子柑橘、葡萄。二、脱毒效果检测方法经过脱毒处理的植株是否还存在病毒须经过病毒学检测才能确定。可靠的病毒检测方法与建立有效的脱毒方法同等重要。传统上一直沿用的检测方法是目测法但是这种方法无法剔除潜隐性病毒。后来出现的指示植物法扩大了检测范围。近年来随着生物科学的迅猛发展免疫学方法分子生物学方法等许多先进的理化技术的应用促进了病毒检测技术的改进与发展。下面简要介绍几种检测脱毒苗的方法。1〃性状鉴定。脱毒苗叶色浓绿均匀一致长势好。带毒株长势弱叶片表现褪绿条斑扭曲、植株矮化大蒜花叶或明脉坏死。卷叶、植株矮缩等马铃薯花叶褪绿斑点甘薯、康乃馨等表现出病毒病症状的植株可初步定位病株。根据症状诊断要注意区分病毒病症状与植物的机械损伤虫害及药害等表现如果难分辨需结合应用其他诊断、鉴定方法综合分析、判断。2〃指示植物法。当原始寄主的症状不明显时,就可用指示植物法,因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。具体做法是将病叶研磨,把汁液接种到寄主植物上。指示植物法简便易行但它灵敏性差所需时间长难以区分病毒种类。3〃血清学方法。抗血清鉴定法要进行抗原的制备抗血清的采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中贮存在-1525℃的冰冻条件下。测定时把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合这一反应导致形成可见的沉淀然后根据沉淀反应来鉴定病毒。此法灵敏度高获得检测结果迅速是目前检测病毒的一种最好方法。此外PCR微量板杂交法、蛋白质电泳法、嫁接检测法、电子显微镜检定法、病毒症状学诊断法等也可以用来检测植物病毒。4〃电子显微镜检测。采用电子显微镜既可以直接观察病毒检查出有无病毒存在了解病毒颗粒的大小、形状和结构又可鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法但需一定的设备和技术。由于电子的穿透力很低制品必须薄到10100μm通常制成厚20μm左右的薄片置于铜载网上才能在电子显微镜下观察到。近代发展使电镜结合血清检测病毒称为免疫吸附电镜ISEM。252农家科技