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一种石榴花多酚的抗炎用途.pdf

来源：花匠小妙招时间：2024-11-07 16:35

一种石榴花多酚的抗炎用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种维吾尔医常用药材—石榴花多酚在制备抗炎的药物或保健品中的用途。
背景技术
炎症是临床常见的一个病理过程，可发生于机体各组织和器官，当机体遭遇到一种病原体侵袭时，它会释放出一系列的细胞因子，将免疫细胞吸引到感染位点并引起炎症，因此可以说炎症是人体用来对抗感染的一种防御机制。但是炎症失控也会引起一系列的病理反应，如严重的感染和败血症，阿尔茨海默氏症、动脉粥样硬化和2型糖尿病等。巨噬细胞是机体的第一道免疫防线，一旦机体受创,巨噬细胞就能大量分泌多种巨噬细胞源性生物因子，包括转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）、白细胞介素（Interleukin，IL）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF）、单核趋化因子1（Monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）以及一氧化氮（Nitric oxide, NO）等，这些生物活性物质直接影响着机体修复的进程。NO是体内重要的生理递质、细胞内外信息传递的化学信使，它参与机体生理过程的调节和宿主防御及免疫反应。很多疾病发生时，NO的含量是增加的，并通过增加局部血流促进血浆的渗出及水肿的形成，NO在炎症反应中发挥了复杂作用。通过对药物抑制LPS诱导的炎症细胞模型产生的过量NO蛋白的研究，可揭示药物的抗炎活性。细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组分之一，在人体免疫系统对抗细菌入侵时，LPS作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞捕获，启动胞内信号传递链,引起核因子κB等活化,启动核基因转录,表达和释放多种促炎症细胞因子（如IL-6、TNF-α等）、促炎介质（NO、和前列腺素E2（PGE2）等）和转化生长因子β（TGF-β1）。炎症的发生都伴随着炎症因子的大量释放，故而细胞内炎症因子的含量可直接反应细胞炎症的水平。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一, 在介导炎症反应和细胞因子生成中起着重要的作用，尤其细胞外调节蛋白激酶（ERK）和C-JUN氨基末端激酶（JNK）能被多种炎性刺激所激活, 并对炎症的发生、发展起重要调控作用。另外，前列腺素合成步骤中的关键限速酶:环氧合酶-2（COX-2）的激活与炎症反应也有密切关系。
目前使用的炎症治疗物多为合成药物(例如布洛芬)、抗组胺剂、类固醇、可的松、免疫抑制剂和免疫激动剂，但这些药物仅暂时性地缓解炎症且具有诸如超敏反应和免疫系统退化等副作用。现在传统的合成类抗炎药物已很难满足社会需求，天然药物成为医药界关注的热点。石榴是石榴属石榴科植物，落叶灌木或小乔木。石榴作为一种药食两用植物，可以说“全身是宝”，果实、果皮、根、花、叶皆可入药，石榴的果实中含有丰富的碳水化合物、蛋白质、各种氨基酸和人体所必需的微量元素和各种维生素；石榴的果皮中含有碱性物质，有驱虫功效；石榴汁含有多种氨基酸和微量元素，有助消化、抗胃溃疡、软化血管、降血脂和血糖。可见，石榴的各部分含有丰富的活性物质，表现出很强的生物活性，石榴花也不例外。石榴花作为中药和维吾尔常用药，用于治疗中耳炎、鼻衄、创伤出血。石榴花作为新疆特色植物，资源丰富，极具开发利用价值。目前科研工作者对石榴汁，石榴籽油，石榴皮的提取物及衍生物已经进行了大量的研究，然而对石榴花研究多集中在它的化学成分和制备工艺方面，石榴花相关的生物活性的研究甚少，尤其石榴花多酚的抗炎作用国内未见报道。本发明所述的一种石榴花多酚是参照热依木古丽. 阿布都拉等人发表在《食品科学》上的方法提取获得。本发明涉及的石榴花多酚能抑制细胞致炎因子IL-6、IL-1B、TNF-α和炎症介质NO，并且呈一定的剂量依赖性；并降低炎症信号通路中的三个关键酶ERK、JNK和COX-2的表达水平，可见石榴花多酚具有良好的抗炎活性。
发明内容
本发明目的在于，提供一种石榴花多酚的抗炎用途，经酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测石榴花多酚对RAW264巨噬细胞增殖的影响，结果表明：石榴花多酚显著抑制炎症介质一氧化氮(NO)的过量释放；抑制炎症因子白介素6、白介素1β 和肿瘤坏死因子α的过度分泌。蛋白免疫印迹法显示石榴花多酚可抑制炎症信号通路中的三个关键酶：细胞外调节蛋白激酶、C-JUN氨基末端激酶和环氧酶2的过量表达。由此可见，石榴花多酚具有良好的抗炎活性，可作为抗炎药物的先导化合物用于预防或治疗由一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素6 (IL-6)或白介素1β (IL-1β)过量而导致的炎症。
本发明所述的一种石榴花多酚抗炎的用途，所述石榴花多酚作为原料或辅助剂在制备抗炎药物中的用途。
所述石榴花多酚作为原料或辅助剂在制备保健品中的用途。
所述抗炎是由巨噬细胞释放过量炎症细胞因子包括白介素6、白介素1β 和肿瘤坏死因子α或炎症介质为巨噬细胞释放的一氧化碳而导致的炎症。
附图说明
图1本发明实施例1中石榴花多酚对RAW264.7巨噬细胞的存活率的影响示意图；
图2本发明实施例2中石榴花多酚对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO的抑制作用示意图，其中“+”表示有脂多糖，“-”表示没有脂多糖；
图3本发明实施例3中石榴花多酚对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-6的影响示意图，其中“+”表示有脂多糖，“-”表示没有脂多糖；
图4本发明实施例4中石榴花多酚对LPS刺激RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响示意图，其中“+”表示有脂多糖，“-”表示没有脂多糖；
图5本发明实施例5中石榴花多酚对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响示意图，其中“+”表示有脂多糖，“-”表示没有脂多糖；
图6本发明实施例6中石榴花多酚对LPS刺激RAW264.7细胞表达的ERK, JUK及COX-2三种蛋白的磷酸化水平的影响示意图，其中“+”表示有脂多糖，“-”表示没有脂多糖。
具体实施方式
实施例1
石榴花多酚作为抗炎药物或保健品的用途的生物活性筛选：
MTT比色法测定细胞活力：取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜后，加入不同浓度的石榴花多酚（10-100μg/mL）溶液，考察药物加入后对细胞的影响，上述各药物组细胞培养过夜后，在各孔细胞中加入5 mg/mL MTT 20μL，温度37℃，5%CO2条件下继续孵育4 h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光值( 图1 )。
实施例2
石榴花多酚作为抗炎药物或保健品的用途的生物活性筛选：
格里斯(Griess)法测定一氧化氮（NO）含量：考察石榴花多酚对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症反应的抑制作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞传代后在含10%胎牛血清（FBS）的高糖细胞培养基DMEM（dulbecco's minimum essential medium，DMEM，Gibico公司）中培养，加不同浓度的石榴花多酚（10-100 μg/mL），细菌脂多糖 (1μg/mL)诱导炎症反应，16h后收集上清液。Griess法测定细胞上清液中一氧化氮的含量，根据不同浓度对细菌脂多糖诱导的RAW 264.7细胞释放一氧化氮（NO）的影响，用以反映一氧化氮（NO）水平( 图2 )。
实施例3
石榴花多酚作为抗炎药物或保健品的用途的生物活性筛选：
ELISA法测定白介素6（Interleukin-6，IL-6）：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/ml，每孔1mL，温度37℃，5%CO2条件下培养，石榴花提取物组（终浓度为10、25、50、100μg·mL-1），在上述药物组的基础上，每孔加入细菌脂多糖（终浓度为1 μg/mL），先加入药物培育1h后，再加入细菌脂多糖，刺激细胞共孵育16 h，每组处理重复3孔。ELISA法测定石榴花多酚处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-6细胞因子的含量 ( 图3 )。
实施例4
石榴花多酚作为抗炎药物或保健品的用途的生物活性筛选：
ELISA法测定白介素1β（IL-1β）：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/ml，每孔1mL，温度37℃，5%CO2条件下培养，石榴花提取物组（终浓度为10、25、50、100μg·mL-1），在上述药物组的基础上，每孔加入细菌脂多糖LPS（终浓度为1 μg/mL），先加入药物培育1h后，再加入细菌脂多糖LPS，刺激细胞共孵育16 h，每组处理重复3孔。ELISA法测定石榴花多酚处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的白介素1β (IL-1β) 因子的含量 ( 图4 )。
实施例5
石榴花多酚作为抗炎药物或保健品的用途的生物活性筛选：
ELISA法测定肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/ml，每孔1mL，温度37℃，5%CO2条件下培养，石榴花提取物组（终浓度为10、25、50、100μg·mL-1），在上述药物组的基础上，每孔加入细菌脂多糖（终浓度为1 μg/mL），先加入药物培育1h后，再加入细菌脂多糖，刺激细胞共孵育16 h，每组处理重复3孔。ELISA法测定石榴花多酚处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α (TNF-α)的含量 ( 图5 )。
实施例6
石榴花多酚作为抗炎药物或保健品的用途的生物活性筛选：
蛋白免疫印迹法(western blotting)：: 将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/ml，每孔1mL，温度37℃，5%CO2条件下培养，石榴花提取物组（终浓度为10、25、50、100μg·mL-1），在上述药物组的基础上，每孔加入细菌脂多糖（终浓度为1 μg/mL），先加入药物培育1h后，再加入细菌脂多糖，刺激细胞共孵育16 h，每组处理重复3孔，收集脂多糖诱导后的RAW264.7巨噬细胞的总蛋白，通过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、孵育抗体、显影过程，定量分析炎症反应中几个关键酶的表达量，包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、C-JUN氨基末端激酶(JUK)和环氧酶2（COX-2）的磷酸化水平( 图6 )。
根据实施例1-5的检测得出以下结论：
本发明所述的石榴花多酚对巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；
本发明所述的石榴花多酚可有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生过量的炎症介质NO，且其作用呈现浓度依赖性；
本发明所述的石榴花多酚可有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞过表达的三种炎症细胞因子：肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素6 (IL-6)、白介素1β (IL-1β)。
本发明所述的石榴花多酚可有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞过量表达的炎症信号通路中的三个关键酶：细胞外调节蛋白激酶(ERK)、C-JUN氨基末端激酶(JUK)和环氧酶2（COX-2）。
本发明涉及的石榴花多酚可有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生的过量炎症介质NO，抑制RAW264.7细胞分泌的过表达的致炎因子：白介素6 (IL-6)、白介素1β (IL-1β) 和肿瘤坏死因子α (TNF-α)，同时抑制炎症信号通路中的三个关键酶：细胞外调节蛋白激酶(ERK)、C-JUN氨基末端激酶(JUK)和环氧酶2（COX-2）。以上结果证明石榴花多酚具有良好的抗炎活性，可作为抗炎药物先导化合物用于预防或治疗由NO、TNF-α、IL-6或IL-1β过量而导致的炎症。