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不同产地连钱草药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究.docx

来源：花匠小妙招时间：2026-02-23 21:08

不同产地连钱草药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究

连草是嘴唇科植物的活血丹（glechoma）kpor干燥的土壤。具有利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿的功能。主治尿路结石、疳积、黄疸、感冒、肺痈、咳嗽、小儿惊风、跌打扭伤、骨折、风湿性关节炎等疾病。湖北省民间常用新鲜连钱草治疗腹泻,疗效较好,其抗腹泻作用机理近年来已得到初步研究。我国连钱草资源极为丰富,除西北和内蒙古外,全国各地均有分布。据报道,测定连钱草中熊果酸和总黄酮的质量分数可控制该药材质量。但这种测定单一成分和有效成分质量分数的方法并不能全面反映连钱草药材的内在质量,因为中药的药效往往是多成分协同作用的结果。中药指纹图谱不强调中药单一指标的绝对唯一性,而强调中药多成分、多指标的整体性及中药内在质量的均一性和稳定性,是现阶段可以全面反映中药内在质量的一个有效手段。本文采用高效毛细管电泳(HPCE)建立了连钱草药材的指纹图谱,对4个产地及对照药材的指纹图谱进行了比较分析,为连钱草药材的质量评估提供了一定科学依据。1药品、化学品、乙酰氨基酚对照品CAPEL-105型毛细管电泳仪(LUMEX,俄罗斯),配有可调波长的UV检测器和Chrom&Spec1.5X数据处理系统;pH计(上海雷磁公司)。连钱草对照药材(中国药品生物制品检定所,批号121386-200401);对乙酰氨基酚对照品(中国药品生物制品检定所);乙醇、乙腈及硼酸(分析纯);湖北咸宁和四川产连钱草购于湖北省医药有限公司,湖北武汉和湖北恩施产连钱草自行采集,经湖北中医学院中药鉴定教研室鉴定为唇形科植物活血丹(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)的干燥地上部分。2方法和结果2.1连钱草供试溶液的配制内标溶液的配制精密称取对乙酰氨基酚0.0756g,用乙醇溶解并定容至50mL,摇匀,得10mmol·L-1的内标溶液。供试溶液的配制精密称取干燥的连钱草粉末5g,加入体积分数75%乙醇50mL,加热回流30min,趁热过滤。重复提取2次。合并滤液,减压浓缩,加入内标溶液0.5mL,并用体积分数75%乙醇定容至50mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得供试溶液。其中,内标物浓度为0.1mol·L-1。2.2测试方法未涂层融熔石英毛细管50μmI.D.×375μmO.D.,总长62cm,有效长度53.5cm(河北永年锐沣色谱器件有限公司);检测波长278nm;压力进样3kPa,15s;电压25kV;毛细管温度25℃;电泳缓冲液:50mmol·L-1硼酸缓冲液(pH9.2),并含有体积分数15%乙腈。毛细管使用前分别以0.1mol·L-1氢氧化钠溶液、重蒸馏水和电泳缓冲液依次冲洗10min、10min、15min,每2次电泳之间用电泳缓冲液冲洗5min。2.3指纹谱的构建2.3.1贸易投资电泳结果按“2.1”项下方法制备不同产地连钱草药材的供试溶液,每个产地进样2次,记录电泳图,共考察了60min,发现在20min后没有电泳峰出现。比较4个产地和对照药材供试溶液的电泳结果,以电泳峰的相对迁移时间(电泳峰与对乙酰氨基酚内标物迁移时间的比值)定性,确定共有指纹峰为16个(见图1)。不同产地连钱草药材共有峰的相对迁移时间和相对峰面积(共有峰与内标物峰面积的比值)见表1。2.3.2指纹图谱检测取一份湖北咸宁产连钱草供试溶液,分别在0,1,2,6,8,12h检测指纹图谱。以共有峰的相对迁移时间计算,RSD小于2.6%;以共有峰的相对峰面积计算,4号峰的RSD为6.4%,14号峰的RSD为5.6%,其余共有峰的RSD均小于5%。说明供试溶液在12h内基本稳定。2.3.3共有峰相对峰面积和相对峰同时点的rsd取一份湖北咸宁产连钱草供试溶液,连续进样5次,各共有峰相对迁移时间的RSD小于2.6%,相对峰面积的RSD除4号峰为5.4%外,其余共有峰的RSD小于5%。说明方法的精密度较好。2.3.4目标迁移时间和相对峰面积的rsd精密称取干燥的湖北咸宁产连钱草药材粉末5份,每份5.0g,按“2.1”项下制备供试溶液,测定其指纹图谱,各共有峰相对迁移时间的RSD小于2.3%,相对峰面积的RSD除4号峰、14号峰分别为7.2%、6.1%外,其余共有峰的RSD小于5%。说明方法的重现性较好。2.3.5测定样品峰重叠率指纹图谱及其峰重叠率5种连钱草药材的指纹图谱见图1和表1。峰重叠率是在2个相互比较样品的各自峰数及两者共有峰数的基础上,从质的角度考察2个样品的相关性。即:重叠率=[待测样品与对照样品共有峰数×2/(待测样品峰数+对照样品峰数)]×100%。将连钱草对照药材作为对照样品,求得4个产地连钱草药材指纹图谱的峰重叠率分别为49.2%(咸宁),51.6%(武汉),59.2%(四川),60.3%(恩施)。指纹图谱的8强峰8强峰是指样品电泳峰中相对峰面积较大的前8个电泳峰,是从量的角度考察不同样品的差异性。表2是5种连钱草药材指纹图谱的8强峰。3电泳峰的分离和测定3.1取相同量的连钱草药材,以共有指纹峰的相对峰面积之和为考察指标,对提取方式(蒸馏法,超声法)、提取溶剂(甲醇,乙醇)、提取时间(30min,60min,90min)、提取溶剂体积分数(45%,60%,75%,)、提取溶剂体积(药材重量的6倍,8倍,10倍)和提取次数(1次,2次,3次)进行优化,其中后面4项指标的优化采用正交设计法。结果表明,连钱草药材用10倍于其重量的体积分数75%乙醇蒸馏2次,每次30min,提取效果最佳。3.2考察了不同波长处(220nm,254nm,278nm,300nm,325nm)连钱草供试溶液的电泳图谱,发现在278nm处检测到的电泳峰数目最多。研究了不同浓度的硼酸缓冲液(10～50mmol·L-1)、磷酸盐缓冲液(10～50mmol·L-1)、不同pH值(pH5～10)及有机改性剂体积分数(5%～20%,)对连钱草提取物分离的影响。结果表明:pH值的改变对分离的影响最大,pH9.2时分离出的电泳峰最多(见图2);乙腈的加入使电泳峰的峰形及分离情况均得到改善。综合考虑,确定最优电泳条件为:电泳缓冲液为含体积分数15%乙腈的50mmol·L-1硼酸缓冲液(pH9.2);检测波长278nm;电压25kV;温度25℃。3.3从图1和指纹图谱的峰重叠率可以看出,不同连钱草样品的指纹图谱有一定差别,4种产地连钱草的峰重叠率都偏低,表明连钱草的主要化学成分种类因产地不同而有较大差异,与对照药材的差异性从小到大依次为湖北恩施、四川、湖北武汉、湖北咸宁。由表1可见,各共有峰的相对峰面积差别较大,其中15,16号峰的相对峰面积差异最显著。从表2可见,12号共有峰(St为2.194)均以较高质量分数进入8强峰,说明该成分是连钱草的最主要成分之一;5,6,13,14,15,16号共有峰(St分别为1.554,1.717,2.263,2.349,2.536,3.018)均分别在2个连钱草样品中进入8强峰,其中,16号共有峰以较高质量分数进入湖北武汉和湖北恩施产连钱草的8强峰,说明该成分也是这两个产地连钱草的最主要成分之一;4种连钱草的8强峰相对峰面积之和大小不一,四川产最小,湖北恩施产最大,表明连钱草的主要化学成分质量分数因产地不同而有较大差异,与对照药材的差异性从小到大依次为湖北咸宁、四川、湖北武汉、湖北恩施,这与主要化学成分种