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黄芪多糖对非酒精性脂肪性肝炎大鼠ACE2

来源：花匠小妙招时间：2025-12-19 12:39

马燕花，邱晓青，师霞，余臣祖

（1.甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州 730020）

非酒精性脂肪性肝病是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝脏损伤，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化和肝细胞癌［1-2］，该疾病由于可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等终末期肝病，一直备重视。研究表明，非酒精性脂肪性肝病小鼠有明显的胰岛素抵抗［3］，其所致肝细胞内甘油三脂蓄积被认为是重要致病因素。胰岛素受体底物-1（IRS-1）是胰岛素信号转导途径中的重要因子，在胰岛素抵抗中起到重要作用［4］。

肾素血管紧张素系统（RAS）存在对立、统一的2 条轴：血管紧张素转换酶（ACE）-血管紧张素Ⅱ（1-8）［AngⅡ（1-8）］-血管紧张素Ⅱ 1 型受体（AT1）轴、血管紧张素转换酶 2（ACE2）-血管紧张素（1-7）［Ang-（1-7）］-［Ang-（1-7）］受体（MAS）轴［5］。研究表明［6-8］，AngⅡ参与并促进胰岛素抵抗发生，而 ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴作为RAS 的一个负调节轴，对胰岛素抵抗的发生有抑制作用［9］。本实验用黄芪多糖对非酒精性脂肪性肝炎大鼠进行干预，探讨其对ACE2-Ang-（1-7）-Mas 轴及胰岛素抵抗的影响，进一步阐明该成分的分子生物学机制，为相关临床应用提供实验依据。

1.1 动物 SPF 级雄性 SD 大鼠 40 只，体质量180～220 g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，许可证号 SCXK（甘）2015-0001，动物饲养于甘肃中医药大学实验动物中心，室内温度（22±2）℃左右，相对湿度 50%～60%左右，12 h 光照维持，昼夜循环，适应性喂养1 周，自由摄食饮水，普通饲料喂养。本实验遵循甘肃中医药大学实验动物中心实验动物使用管理规定，并通过甘肃中医药大学动物伦理委员会批准。

1.2 试药黄芪多糖购自南京泽朗生物科技有限公司，含有量90.11%。盐酸吡格列酮由北京太洋药业股份有限公司生产，规格 15 mg，7 片／盒，批号161101，购自甘肃中医药大学附属医院。高脂饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供（普通饲料＋15% 猪板油＋1% 胆固醇＋10% 蛋黄粉＋0.2% 胆酸钠），真空包装成10 kg／袋。丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号 13352801）、天冬氨酸氨基转移酶（AST，批号 14640501）、总胆固醇（TC，批号13585401）、甘油三酯（TG，批号 14854801）试剂盒均购自德国罗氏公司；MDA（批号 s0131）、SOD（批号s0101）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Ang1-7 ELISA 检测试剂盒（批号RA036）购自上海歌凡生物科技有限公司；DEPC（批号 E174）购自美国 Amresco 公司；Trizol（批号9109）、qPCR 反应试剂盒（批号 RR420 A）、反转录试剂盒（批号RR047 A）购自日本TakaRa 公司；ECL 发光液、PVDF 膜购自美国 Millopore 公司；羊抗IgG 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ACE2（批号 ab108252）、IRS-1（批号 ab131487）、MAS（批号 ab200685）一抗均购自英国 Abcam 公司；β-actin 购自美国 CST 公司。

1.3 仪器 iMark 酶标仪、Western blot 转膜仪、电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）；Mx3005P 实时定量PCR 扩增仪（美国 Agilent 公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模及分组高脂饲料建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。大鼠常规喂养7 d 后，随机分为正常组［普通标准饲料（总热量15.335 J／g，碳水化合物占53%，脂肪占 9%，蛋白质占 20%）］、造模组（高脂饲料），第12 周末随机处死造模组大鼠2 只，取出肝脏作病理切片，发现模型建立成功。将造模成功大鼠（30 只）随机分为模型组、黄芪多糖组、吡格列酮组［10］，每组 10 只，灌胃给药，其中黄芪多糖组［11-12］剂量为 400 mg／kg 灌胃，吡格列酮组剂量为 20 mg／kg，正常组、模型组为等容量生理盐水，灌胃体积1 mL／100 g，各组大鼠饮食不变，连续给药 4 周，1 次／d，观察大鼠进食、饮水、行为、活动、精神状态、毛发、大小便等情况，每1 周记录动物体质量1 次，持续至16周。然后，大鼠禁食 24 h，次日腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉，下腔静脉取血，3 000 r／min 离心15 min，分离血清，-20 ℃下保存，迅速取出肝脏，称定肝湿重，-80 ℃下冷冻保存。

2.2 肝指数检测实验结束时称定大鼠体质量和肝湿重，肝指数=（肝湿重／体质量）×100%。

2.3 血清肝功能、血脂指标检测全自动生化分析仪检测 ALT、AST、TG、TC 水平，黄嘌呤氧化酶法检测SOD 水平，硫代巴比妥酸法检测 MAD水平。

2.4 血清 Ang（1-7）水平检测取待测血清50 μL，加入 ELISA 试剂盒检测孔中，根据说明书进行操作，酶标仪于450 nm 波长下测定吸光度（A），结合标准曲线计算检测血清 Ang（1-7）水平。

2.5 肝脏组织病理学变化观察取部分大鼠肝组织，4%多聚甲醛固定，常规制备组织石蜡切片，HE 染色，光镜下进行观察。

2.6ACE2、Mas、IRS-1 mRNA 表达检测采用RT-PCR 法。取 100 mg 左右大鼠肝组织，Trizol 法提取总RNA，超微量分光光度计测定样品质量浓度（ng／μL），测得A260nm／A280nm比值在1.8～2.1 之间，提示 RNA 质量较好，取 1 μg RNA 样品用于合成cDNA。按照RT-PCR 试剂盒说明书操作步骤对ACE2、Mas、IRS-1 进行 PCR 扩增，三者 mRNA 检测所需引物均根据标准RT-PCR 引物设计原则，由大连宝生物工程有限公司设计并合成（表1）。采用两步法 PCR 反应程序（体积 25 μL），第一步95 ℃ 30 s；第二步 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，44 个循环，靶基因相对表达量用 2-ΔΔCt计算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表达检测采用Western blot 法。取20 mg 左右冷冻的大鼠肝脏组织样本，剪碎，加入RIPA 组织裂解液提取各组肝组织总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，取 40 μg 蛋白，10%SDS-PAGE 分离后电转运至PVDF 膜上，置于2%酪蛋白溶液中，室温下振摇 1.5 h，加入兔抗鼠 ACE2、兔抗鼠 Mas，兔抗鼠 β-actin 单抗（1 ∶1 000 稀释），4 ℃ 下孵育过夜；TBST 洗膜 3 次，加入二抗室温孵育 1 h，加入HRP 标记的山羊抗兔 IgG（1 ∶2 000 稀释），再洗膜3 次，加入 ECL 发光液压片显影，扫描摄取图像。然后，用Quantity one 软件分析条带的灰度值，以 ACE2、Mas、IRS-1 与 β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

2.8 统计学分析通过SPSS 19.0 进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肝指数表2显示，与正常组比较，模型组肝指数显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪多糖组肝指数均显著下降（P＜0.01）。

表2 黄芪多糖对肝指数的影响（， n=10）Tab.2 Effects of Astragali Radix polysaccharides on liver indices（， n=10）

注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，▲▲P＜0.01

组别体质量／g 肝湿重／g 肝指数／%正常组 287.63±75.82 10.43±2.70 3.64±0.18模型组 272.20±71.42 11.53±2.89 4.29±0.41#黄芪多糖组 296.20±66.57 6.87±0.97 2.36±0.23▲▲吡格列酮组 303.90±88.71 7.50±1.92 2.50±0.20▲▲

3.2 血清指标表3显示，与正常组比较，模型组 ALT、AST、TC、TG、MDA、Ang1-7 水平显著升高（P＜0.05），SOD 水平显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，黄芪多糖组 ALT、AST、TC、TG、MDA 水平显著降低（P＜0.01），Ang1-7、SOD 水平显著升高（P＜0.01）。

3.3 肝脏组织病理学变化图1显示，正常组大鼠肝组织肝小叶结构完整，肝索、肝窦分布正常，肝细胞形态一致，未见明显变性坏死，小叶内及汇管区未见明显淋巴细胞浸润；模型组大鼠肝组织肝小叶结构完整，肝索明显增宽，肝窦融合，可见肝细胞弥漫性脂肪变，部分区域汇管区及小叶内少量淋巴细胞浸润；与模型组相比，黄芪多糖组、吡格列酮组大鼠肝组织脂肪变及炎症反应明显减轻，仅少数区域肝细胞内见极少量大小不等脂肪空泡，汇管区及小叶内未见明显淋巴细胞浸润。

3.4ACE2、Mas、IRS-1 mRNA 表达表4显示，与正常组比较，模型组ACE2、MasmRNA 表达显著升高（P＜0.01），IRS-1 mRNA 表达显著降低（P＜ 0.05）；与模型组比较，黄芪多糖组三者mRNA 表达显著升高（P＜0.01）。

表3 黄芪多糖对血清指标的影响（， n=10）Tab.3 Effects of Astragali Radix polysaccharides on serum indices（， n=10）

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01

组别 ALT／（U·L-1）AST／（U·L-1）TC／（mmol·L-1）TG／（mmol·L-1 ）SOD／（U·mL-1）MDA／（μmol·L-1）Ang1-7／（ng·L-1）正常组 32.40±2.67 120.80±13.61 1.53±0.27 0.63±0.13 423.76±22.46 11.91±1.54 0.08±0.01模型组 44.35±10.53# 182.60±70.16# 1.89±0.22# 1.07±0.29## 131.00±11.22## 30.96±1.19## 0.35±0.04##黄芪多糖组 27.91±8.04▲▲ 115.10±19.33▲▲ 1.46±0.16▲▲ 0.34±0.09▲▲ 328.84±34.45▲▲ 17.55±2.67▲▲ 1.30±0.14▲▲吡格列酮组 26.33±7.46▲▲ 96.55±52.71▲▲ 1.46±0.31▲▲ 0.48±0.08▲▲ 395.89±39.53▲▲ 16.32±1.51▲▲ 1.17±0.07▲▲

图1 各组大鼠肝脏组织病理学变化（HE，×40）Fig.1 Liver histopathological changes of rats in various groups（HE，×40）

表4 黄芪多糖对 ACE2、 Mas、 IRS-1 mRNA 表达的影响（， n=10）Tab.4 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2， Mas and IRS-1 mRNA expressions（，n=10）

注：与正常组比较，# P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01

组别 ACE2 Mas IRS-1正常组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型组 2.51±0.47## 2.60±0.23## 0.6071±0.004#黄芪多糖组 3.97±0.36▲▲ 6.12±0.43▲▲ 6.115±0.155▲▲吡格列酮组 7.96±0.54▲▲ 6.38±0.49▲▲ 1.349±0.00848▲▲

3.5 ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表达表5、图2显示，与正常组比较，模型组 Mas、ACE2 蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01），IRS-1 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪多糖组三者蛋白表达显著升高（P＜0.05）。

4 讨论

非酒精性脂肪性肝炎的发生与胰岛素抵抗密切相关，被认为是代谢综合征的肝脏表现［13］，胰岛素的代谢功能主要通过磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3k）信号途径实现，它通过与胰岛素受体结合来使后者底物蛋白（IRS）磷酸化，进一步激活PI3k，并导致蛋白激酶B（Akt／PKB）磷酸化而发挥胰岛素生物学效应［14］。IRS 是 1种具有胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶活性的、结构相似的信号蛋白，主要包括IRS-1、IRS-2，其中前者表达于肝脏、骨骼肌等组织，是胰岛素信号转导途径中的重要因子，在胰岛素抵抗中起着重要作用［15］。

表5 黄芪多糖对ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表达的影响（，n=10）Tab.5 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2，Mas and IRS-1 protein expressions（，n=10）

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 ACE2 Mas IRS-1正常组 0.68±0.09 0.80±0.01 0.97±0.06模型组 1.30±0.28## 0.94±0.09# 0.84±0.03#黄芪多糖组 1.68±0.12▲ 1.09±0.07▲ 0.96±0.03▲吡格列酮组 1.77±0.23▲ 1.42±0.03▲▲ 1.04±0.10▲▲

ACE2 是 2000年由 Donoghue［16］、Tipnis［17］研究小组发现的RAS 家族新成员，其主要生物学作用是水解AngⅠ、AngⅡ，从而产生降解产物Ang-（1-7），它主要分布在血管、心脏、肾脏、肝脏，与其特异性受体MAS 结合而发挥生物学作用，Mas受体由Mas 原癌基因编码，属于7 次跨膜的G 蛋白偶联受体，表达于人类及大鼠心脏、肾脏、肝脏、脂肪组织、睾丸、骨骼肌、视网膜色素上皮等部位，正常肝脏中 ACE2-Ang-（l-7）-Mas、ACEAngⅡ-AT1R 系统均有表达［18］，而当肝脏损伤时两者均表现为表达上调。研究表明，非酒精性脂肪性肝炎大鼠经AngⅡ处理后胰岛素抵抗程度明显加重，而敲除AT-1 受体或给予ARB 预处理后明显减轻［19］，AngⅡ可通过促进胰岛素受体丝氨酸磷酸化，抑制IRS-1 酪氨酸磷酸化，从而降低胰岛素敏感性［20］；ACE2-Ang（1-7）-Mas 系统通过促使IRS-1 磷酸化来激活 PI3k 信号转导通路，降低血脂、改善胰岛素抵抗［21-22］。研究表明，Ang-（1-7）转基因大鼠血脂水平明显降低，胰岛素敏感性增强［23］，而且Mas 基因敲除小鼠出现血脂水平升高、胰岛素抵抗［24-25］。

图2 各组 Mas（a）、ACE2（b）、IRS-1（c）蛋白表达Fig.2 Mas（a），ACE2（b）and IRS-1（c）protein expressions in various groups

黄芪作为传统中药材，具有扶正补气之功效，黄芪多糖是其重要的天然有效成分，具有扶正固本、补中益气、化痰祛脂功效［26］，可降低血脂，增加胰岛素敏感性［27］，但其具体降脂护肝机制尚不明确。本实验用黄芪多糖对非酒精性脂肪性肝炎大鼠进行治疗，观察其对 ACE2-Ang-（l-7）-Mas系统及IRS-1 表达的影响，发现模型大鼠血清转氨酶、血脂、Ang-（l-7）水平明显升高，肝组织ACE2、Mas 表达明显增加，IRS-1 表达明显减低，而黄芪多糖干预后大鼠血清转氨酶、血脂明显降低，Ang-（l-7）水平及 ACE2、Mas、IRS-1 表达模型提高，病理学检查显示，肝组织脂肪变性明显减轻。由此可知，黄芪多糖能显著改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰岛素抵抗，具有很好的降脂、保肝作用，其机制可能与上调 ACE2、Mas、Ang-（l-7）水平，进而促进IRS-1 磷酸化有关。