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一种基于无抗性标记技术构建低白僵菌素蝉花菌株的方法及应用

来源：花匠小妙招时间：2025-10-30 09:27

本发明属于真菌分子生物学，具体涉及一种无抗性标记技术对蝉花目的基因的改造及应用。

背景技术：

1、蝉花(cordyceps chanhua)是一种珍贵的食药用真菌，也是我国传统的名贵中药材，作为一种具有良好应用前景的药食同源菌，被作为一种重要的保健食品进行工业化生产具有很高的经济价值。现代研究表明蝉花具有抗肿瘤、抗疲劳、免疫调节及改善肾功能等多种生理功效，已在蝉花中发现核苷类、多糖、氨基酸、芳香族等多种物质成分。2021年我国卫生健康委员会批准人工培育的蝉花子实体可作为新食品使用，将蝉花的应用领域从传统中医扩展到食品领域，应用范围进一步扩大，使得未来蝉花需求量急剧增加，市场潜力巨大。

2、白僵菌素(beauvericin，bea)为真菌毒素，是蝉花、球孢白僵菌(beauveriabassiana)等虫生寄生菌感染节肢动物的过程中产生的一种次级代谢产物。白僵菌素还被证明有抗肿瘤、抑菌、抗病毒等作用，具有较大潜在的药用价值，但同时对多种细胞系表现出一定的毒副作用。此外，白僵菌素还被发现是多种谷物以及谷物产品的污染物，其含量是谷物及其制品、植物油和坚果等食品安全风险评估中重点检测的指标之一。2020年，国家卫生健康委发布《国家卫生健康委关于蝉花子实体(人工培植)等15种“三新食品”的公告》(2020年第9号)，明确要求蝉花子实体中白僵菌素含量≤3mg/kg。但是，蝉花在生长过程中子实体中白僵菌素含量较高，对服用人群产生潜在的安全危害。

3、营养筛选是因营养缺陷型菌株合成或分解代谢途径异常而需要通过添加外源物质，从而遗传转化筛选的方式。营养缺陷型的标记指有效标记与表达载体连接，常常连接在启动子后面，通过转入的标记基因与受体细胞突变基因互补，使受体细胞表现野生型生长，为转化子提供一种正向选择，从而实现无抗性敲除。营养缺陷型筛选方法是一种优良的筛选标记基因的方法，能够实现不残留抗性或重组位点的无痕敲除，同时消除外源质粒，对后面研究带来极大的便利，也能够提供更精确和可控的基因编辑，从而避免随机整合的盲目性和偶然性，然而在真菌遗传转化过程中，获取合适的营养缺陷型菌株是比较困难，且较费时。

4、筛选标记是对微生物菌株遗传改造所必需的重要工具，蝉花遗传改造中常用的筛选标记主要为抗生素抗性筛选。目前大量研究结果显示，人们使用抗生素改造中常用的筛选标记主要为抗生素抗性筛选。此外，与抗生素抗性筛选相比，利用功能互补的营养缺陷型筛选标记具有生物安全性高，假阳性率低的优势，在食品及饲料工业对于重组蛋白的生产具有更广泛的应用。因此，开发无抗性筛选标记并将其用于构建食品安全菌种对于实现食品领域蛋白的生产具有重要的应用价值。

5、公布号为cn111996129a的中国专利申请文献，公开了一种蝉花isariacicadae新菌株，命名为蝉花isaria cicadae hmgim-n140534，该专利的蝉花菌株是一个采自于野外的活力较强的新菌株，通过野外采集分离出新菌株并保藏于专利菌种保藏中心，经传统鉴定结合分子鉴定确认为蝉花，通过人工发酵可实现大量制备，并且对于抗肿瘤和白色念球菌具有显著的抑制效果。但该专利并不具有低白僵菌素含量的优点，因此还有待进一步提高。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于如何解决现有蝉花子实体中白僵菌素含量高的问题，本发明基于无抗性标记技术，实现对白僵菌素合成调控因子kivr进行突变。

2、本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

3、本发明的第一方面提出一种低白僵菌素含量的蝉花菌株，其保藏编号为cctccno：m2025637。

4、该蝉花菌株已于2025年3月31日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2025637，分类命名为cordyceps chanhua kivi。

5、本发明的第二方面提出上述蝉花菌株的子实体。

6、优选的，所述蝉花的子实体中白僵菌素含量<3mg/kg。

7、本发明的第三方面提出上述蝉花菌株或其子实体在食品蛋白和/或饲料蛋白生产中的应用。

8、本发明的第四方面提出基因kivr在调控真菌代谢中的应用。

9、优选的，调控蝉花中白僵菌素合成含量中的应用。

10、本发明的第五方面提出基因ura3和/或基因kivr在筛选低白僵菌素含量的蝉花菌株中的应用。

11、本发明的第六方面提出一种筛选低白僵菌素含量的蝉花菌株的方法，包括以下步骤：

12、(1)对质粒ppk2-bar进行双酶切去除抗除草剂基因bar，将基因ura3编码区域的上游和下游区域插入到质粒，获得ura3的敲除质粒ppk2-ura3；

13、(2)然后通过同源重组技术和5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-foa)对尿苷/尿嘧啶营养缺陷菌株的筛选作用，获得ura3基因缺失的蝉花菌株；

14、(3)将蝉花ura3编码区域、上游启动子和下游终止子区域插入到质粒获得ppk2-eura3质粒；pcr获得2-酮异戊酸还原酶基因kivr的上下游片段，插入至ppk2-eura3质粒获得kivr敲除质粒ppk2-eura3-kivr，

15、(4)将质粒ppk2-eura3-kivr转化至根癌农杆菌agl-1中，基于同源重组技术获得无抗性标记的kivr敲除菌株，即得。

16、本发明的第七方面提出一种真菌基因敲除载体ppk2-eura3-kivr，其多克隆位点区域依次接有kivr基因上游同源臂、ura3尿嘧啶/尿苷缺陷基因表达框、kivr基因下游同源臂。

17、优选的，kivr基因上、下游同源臂分别为kivr基因orf区域上下游1～1.5k的序列，通过bamhi和spei的酶切位点将片段链接到ppk2-eura3质粒骨架上。

18、乳清酸核苷酸脱羧酶ura3是真菌存活所需的尿苷/尿嘧啶生物合成关键酶，参与氮代谢途径，对尿嘧啶核苷的合成起重要作用。蝉花ura3基因发生突变，相应的突变体不能将乳清酸转化为尿苷(尿嘧啶的前体)，缺失ura3基因的菌株在不含尿苷/尿嘧啶的培养基上无法生长，需要补充外源尿苷/尿嘧啶才能生长。基于ura3基因缺失的菌株这一特性，将ura3基因作为敲除靶基因的标签，敲除靶基因的同时将ura3基因重新插入到ura3基因缺失菌株中，使得菌株能够在不含尿苷/尿嘧啶的培养基上生长。

19、同时，乳清苷酸脱羧酶能够把无毒成分的5-氟乳清酸(5-foa)转变为5-氟尿嘧啶(5-fump)，对细胞有强的生物毒性，从而抑制真菌的生长。然而，在真菌ura3突变菌株中，5-foa不会转变5-fump，意味着ura3突变体可以在含有5-foa的配养基中正常生长。因此，5-foa可作为ura3营养缺陷型菌株的选择剂，在含5-foa和尿苷/尿嘧啶的培养基上筛选能正常生长的蝉花ura3突变菌株，并进一步通过pcr验证确定蝉花ura3基因突变株。

20、ura3标记相对于其他营养缺陷型标记的另外一个优点，即可以反向选择。以δura3为出发菌株，构建kivr基因敲除载体，可通过不含尿苷/尿嘧啶的培养基上筛选能正常生长的蝉花菌株，并结合pcr验证目的基因序列获得蝉花kivr突变菌株。

21、本发明的有益效果在于：

22、1、本发明基于无抗性标记技术，利用基因工程手段，敲除所述白僵菌素合成调控基因kivr，成功获得低白僵菌素的蝉花菌种cordyceps chanhua kivi。这种蝉花菌种经过特殊改造，使其在不具备抗性标记的情况下，实现蝉花子实体中白僵菌素含量<3mg/kg，可直接用于生产。

23、2、本发明首次提供了无抗性标记技术突变真菌代谢相关的蝉花kivr基因及其应用。通过根癌农杆菌介导的遗传转化法实现尿嘧啶/尿苷缺陷基因ura3的靶向敲除，获得ura3基因缺失菌株；再通过根癌农杆菌介导的遗传转化法结合突变株的反向筛选实现kivr的靶向敲除。结果显示，与野生型菌株相比，kivr基因缺失菌株代谢产物中白僵菌素的含量显著降低。同时，本发明对该基因及其作用机制也进行研究，进一步明确了白僵菌素合成调控基因kivr的功能，并解决了现有技术中缺乏在无抗条件下对调控蝉花关键基因研究的问题。

24、3、白僵菌素合成调控基因kivr为一种调控蝉花中白僵菌素合成的关键基因，本发明对基因kivr的功能进行了研究阐释，具有调控白僵菌素合成的作用，本发明所述的遗传工程化宿主细胞具有如下特征：在无抗性标记情况下所述的kivr基因被特异性敲除，白僵菌素产量显著降低。解决了现有技术中缺乏对调控蝉花白僵菌素合成的关键基因功能认识的问题，实现通过基因工程手段降低蝉花白僵菌素的可能性。