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一种根癌农杆菌介导的蝉花虫草真菌基因敲除方法

来源：花匠小妙招时间：2024-11-23 10:37

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及应用根癌农杆菌介导的蝉花真菌中的基因敲除遗传转化方法。

背景技术：

2.蝉花(isaria cicadae miquel)又名金蝉花、蝉茸或蝉草等，是由真菌蝉棒束孢侵染蝉若虫后形成的真菌子座和若虫尸体的复合体。研究发现蝉花含有多糖、核苷类物质、多球壳菌素、麦角固醇及其过氧化物和虫草酸等多种生物活性成分，具有调节免疫和代谢、改善肾功能及抗肿瘤等功效。因此，蝉花作为一种补益食品，其市场需求量日益增加。然而，有研究发现在蝉花的培养物或子座中可检测到环肽类化合物如白僵菌素(beauvericin，bea)、白僵菌酮(bassiatin)和白僵菌酮甲(bassiatin a)等。其中，bea是一种环状六酯肽类真菌毒素，属于新兴镰刀菌毒素，最早从一种昆虫病原真菌球孢白僵菌(beauveria bassiana)中分离得到。六酯肽类真菌毒素包括bea和恩镰孢菌素(enniatins，enns)等，欧洲食品安全局通过风险评估认为人类膳食慢性暴露bea和enns的风险值得关注。
3.真菌的遗传转化一般有以下几种方法：原生质体转化法、脂质体转化法、电击转化法、限制性酶介导整合法、根癌农杆菌介导转化法(agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，atmt)等。根癌农杆菌介导转化法相较于其他转化方法具有显著优越性，首先，该技术实现了对真菌孢子、菌丝体、菌褶、原生质体、子实体等材料的遗传转化，避免了烦琐的原生质体和渗透性敏感细胞的制备，极大简化了转化过程并降低了转化难度；其次，转化效率高，是传统转化方法的140-1000倍；转化子遗传稳定性高，后代转化子遗传特性仍保持85％-98％；转化子t-dna单拷贝插入比例高，为66％-96％。农杆菌介导的遗传转化方法已是目前实现真菌遗传转化应用最广泛的方法之一。利用该方法成功转化的真菌已有100种，而且已有多种真菌利用该方法构建了含丰富类型转化子的突变体库，通过突变体表型来筛选特定的基因。
4.农杆菌主要有根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)2种，是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，在植物酚类物质如乙酰丁香酮(acetosyringone，as)的吸引下经创口感染进入宿主细胞，致癌(tumor-inducing，ti)质粒毒力基因随即开始表达，将农杆菌的t-dna转移至宿主细胞，完成转基因过程。农杆菌内ti质粒上vir(virulence)基因区能与t-dna边界上高度保守的约25bp的碱基序列发生特异性结合，使t-dna在转化过程中不受序列特异性的影响，因此可借助分子克隆技术将内源的t-dna替换成外源基因来完成遗传转化，得到表达外源基因的植物或真菌。
5.目前还未有蝉花虫草真菌的基因敲除方法发表。

技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种利用根癌农杆菌介导的敲除蝉花虫草真菌
基因的方法。
7.本发明构建了敲除蝉花真菌中白僵菌素非核糖体环肽合成酶(isf_00179)beas基因的敲除载体。
8.为解决上述技术问题，本发明提供一种目标基因beas的敲除载体的构建，包括以下步骤：
9.1)、beas基因上下游组合片段基因的获取：
10.从虫草菌的野生型基因组中扩增得到作为目的基因的beas基因的开放阅读框上下游片段；beas基因上游组合片段序列如seq id no:2所述，beas基因下游组合片段序列如seq id no:3所述；
11.2)、步骤1)所得的beas基因上游组合片段序列、beas基因下游组合片段序列与质粒ppk2-bar-gfp重组；重组产物转化于eco.li dh5α感受态细胞中，得到目标基因beas的敲除载体。
12.作为本发明的目标基因beas的敲除载体质粒的构建的改进，所述步骤2)为：
13.2.1)、将上游片段与ppk2-bar-gfp连接后转入eco.li dh5α中，所得重组质粒命名为5
’‑
ppk2-bar-gfp；
14.2.2)、将5
’‑
ppk2-bar-gfp与下游片段连接后转入eco.li dh5α中，所得重组质粒命名为5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’；所述5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’为目标基因beas的敲除载体。
15.beas基因的序列如seq id no:1所述。
16.本发明还同时提供了利用根癌农杆菌介导敲除蝉花虫草菌基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
17.一、制备重组质粒5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’；
18.二、将5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’转入根癌农杆菌中，得工程菌；所述工程菌进行真菌的遗传转化，得农杆菌agl1阳性单菌落；
19.即，本发明为：
20.首先，获取蝉花虫草菌野生型菌株及其基因组dan；
21.其次，ppk2-bar-gfp双标记筛选系统工程菌构建为：从虫草菌的野生型基因组中扩增得到目的基因开放阅读框上下游片段，分别将上述pcr产物与质粒ppk2-bar-gfp重组。重组产物转化于eco.li dh5α感受态细胞中，经pcr验证得到目标基因的敲除载体。将敲除载体转入根癌农杆菌中，即得工程菌，并进行真菌的遗传转化。
22.而后，再进行下述步骤：
23.三、真菌活化培养：
24.于pda平板上取虫草菌菌液划板活化蝉花虫草菌，制取孢子悬液；
25.四、工程菌活化培养：
26.将步骤二所得的农杆菌agl1阳性单菌落，接种到含相应抗生素的lb液体培养基中培养到一定浓度，得到工程菌液；用含有抗生素和乙酰丁香酮(acetosyringone，as)的imas液体培养基中黑暗震荡培养，获取侵染液；
27.步骤五、农杆菌侵染和共培养：
28.将所述步骤四所得的侵染液与所述步骤三所得的孢子悬液1：1混合，共培养于含相应抗生素的固体诱导培养基上，直至其长出白色绒毛状菌丝；
29.所述的诱导培养基：imas基础培养基，400ml
·
l-1 2.5
×
mm salts，0.9g
·
l-1 glucose，10ml
·
l-1 50％ glycerol，40ml
·
l-1 40mm mes ph5.8，20ml
·
l-1 10mm as，15g
·
l-1agar；
30.步骤六、分化筛选：
31.将步骤五中长出的白色绒毛状菌丝的转移到筛选培养基上,接着在此基础上再倒入含有相应抗生素的筛选培养基形成三明治模型，继续培养，直至其长出白色簇状绒毛；
32.所述的筛选培养基：m-100基础培养基，62.5ml
·
l-1 m-100salt solution，10g
·
l-1 glucose，3g
·
l-1 kno3，15g
·
l-1 agar；2ml
·
l-1 200mg/ml cef，1.5ml
·
l-1 200mg/ml ppt；
33.步骤七，二次筛选：
34.将所述步骤六长出的转化子挑取到含相应抗生素的m-100筛选培养基上进行二次筛选，筛选出可能的阳性转化子，并将其转移到pda培养基上，继续培养，直至长出菌株；
35.步骤八：运用两步pcr验证，得到阳性突变菌株。
36.本发明通过根癌农根菌介导，首次通过根癌农杆菌系统介导敲除蝉花虫草菌目的基因并获得突变菌株。
37.本发明首次尝试敲除蝉花虫草真菌的基因。
38.本发明利用分子生物学方法敲除蝉花虫草真菌中白僵菌素的关键合成基因，使利用该菌株培养24天后收获的菌体中白僵菌素不表达或含量极低，即白僵菌素不得检出。敲除白僵菌素的关键合成基因后的菌株应具有不产白僵菌素的遗传稳定性。为针对不产生白僵菌素的蝉花虫草真菌的新药开发提供基础。
附图说明
39.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
40.图1为白僵菌素非核糖体环肽合成酶(beas)基因上游、下游片度pcr电泳图；
41.其中：图1-1为白僵菌素非核糖体环肽合成酶(beas)基因上游片段(1194bp)，图1-2为白僵菌素(beas)基因下游片段(1319bp)。
42.图2为上下游片段分别连上载体质粒的电泳图；
43.其中：图2-1为上游片段连接上ppk2-bar-gfp载体质粒，图2-2为下游片段连接上已连接上游片段5
’‑
ppk2-bar-gfp的载体质粒。
44.图3为验证敲除载体质粒5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’转入农杆菌的电泳图；
45.泳道1、3、4、5、6、7、8为假阳性转化子，泳道2有目的片段条带(1300bp)，为阳性转化子。
46.图4为敲除beas基因后，对转化子菌落pcr“no”验证电泳图；
47.泳道0为野生型虫草菌对照组，泳道1、2、4、6、7、8、9、10为假阳性转化子，泳道3、5无目的片段条带(1639bp)。
48.图5为对第一次筛选的3、5号菌株二次验证，“yes”“no”同时验证电泳图；
49.泳道1、2、3依次为野生型、突变株3号、5号的yes验证，野生型无目的条带(约1500bp)，突变株3、5号菌株有目的条带，泳道4、5、6依次为野生型、突变株3号、5号的no验证，野生型有目的片段条带，突变株无目的片段条带。
50.图6为对获得的两株突变株进行hplc检测其中的白僵菌素含量所得的液相色谱图；
51.其中：图6-1为标品图；图6-2-1～6-2-2为3号突变株进样检测图，2个平行；图6-3-1～6-3-2为5号突变株进样检测图，2个平行。如图所示两个突变株都不产或含量极低。
具体实施方式
52.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
53.本发明的虫草菌来源于文献biological characteristics,bioactive components and antineoplastic properties of sporoderm-broken spores from wild cordyceps cicadae phytomedicine,2017,36:217
–
228中告知的蝉花虫草(cordyceps cicadae)。
54.实施例1、敲除载体质粒的构建
55.1、beas基因上下游组合片段基因的获取
56.于-80℃冰箱中取虫草菌原始菌液，用接种环蘸取菌液于pda固体培养基上划板，活化真菌，28℃恒温培养，培养2周左右；从pda平板上收集蝉花虫草的菌丝，置于预冷的研钵中，液氮速冻后将菌丝研磨成粉末。取适量磨碎的样品(约0.2g)于1.5ml离心管，加入400μl dna裂解缓冲液后上下颠倒混匀。加入等体积平衡酚溶液(ph 7.0)(生工，中国上海)，剧烈震荡3-5min，室温离心(12000rpm)10min。取350μl上清液于新的离心管中，加入5μl rnase，37℃水浴1h。然后加入等体积的平衡酚溶液(ph 7.0)，室温离心(12000rpm)10min。取300μl上清于新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min，使dna充分沉淀。室温离心(14000rpm)10min，弃上清，加入300μl 70％乙醇。室温离心(14000rpm)2min，弃上清，置于37℃干燥1h使乙醇充分挥发，加入适量(60μl)ddh2o溶解沉淀，所得即为基因组dna，其序列如seq id no:1所述。以基因组dna为模版，cc-beas-5-1、cc-beas-5-2为引物扩增beas基因上游片段，cc-beas-3-1、cc-beas-3-2为引物扩增beas基因下游片段。
57.dna裂解缓冲液成分为1.4m nacl，0.1m tris-hcl，20mm edta-na，2％ctab，2％pvp，1％(v/v)β-巯基乙醇，ph值为8.0。
58.扩增体系分别为：
59.(1)kod-plus-neo 1μl，2mm dntps(10mm each)5μl,10
×
pcr buffer for kod-plus-neo 5μl，dna(100ng/μl)4μl，ddh2o 29μl，cc-beas-5-1 1.5μl、cc-beas-5-2 1.5μl。
60.(2)kod-plus-neo 1μl，2mm dntps(10mm each)5μl,10
×
pcr buffer for kod-plus-neo 5μl，dna(100ng/μl)4μl，ddh2o 29μl，cc-beas-3-1 1.5μl、cc-beas-3-2 1.5μl。
61.上述所用的高保真酶均来自杭州硕盟生物科技有限公司。
62.扩增条件为94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃1min，30个循环；68℃5min；将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并选择目的条带进行割胶回收，结果如图1所示，上游片段有1194bp的条带，下游片段有1319bp的条带。
63.取纯化后的pcr产物测序，所得序列与beas基因上下游组合片段序列比对存在一致性。引物序列如下：
64.cc-beas-5-1：5'-atatctctcaggtcggctg-3'
65.cc-beas-5-2：5'-acgtagagagtggtaag-3'
66.cc-beas-3-1：5'-accacgtgctgtccatc-3'
67.cc-beas-3-2：5'-caagatgtccttgatac-3'。
68.beas基因上游组合片段序列如seq id no:2所述，beas基因下游组合片段序列如seq id no:3所述。
69.2、重组质粒载体5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’的构建
70.2.1)、将beas基因上游组合片段和ppk2-bar-gfp质粒用限制性内切酶xbai和ecori 37℃酶切2h以上后使用t4 dna连接酶将两者连接起来，将连接产物化转至eco.li dh5α感受态细胞，涂布于含20μg/ml卡那霉素(km)的lb平板上，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养一天。随机挑选8株转化子进行菌落pcr鉴定。
71.鉴定引物为cc-beas-5-1和bar-up，体系为2
×
taq plus master mix ii 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 8μl，上述所用的酶均来自杭州硕盟生物科技有限公司。
72.反应条件为94℃ 1.5min；94℃ 20s,55℃ 20s,72℃ 2min,30个循环；72℃ 5min；结果如图2-1所示：这1、2号转化子均有1300bp左右的条带，其余6株无对应条带为假阳性。
73.因此表明1、2号转化子为阳性克隆，调取其中一株进行测序，所得序列与beas基因上游组合片段序列比对存在一致性；
74.结果表明上游片段与ppk2-bar-gfp连接完成并成功转入eco.li dh5α中，该重组质粒命名为5
’‑
ppk2-bar-gfp。
75.上述ppk2-bar-gfp质粒例如在《a high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus metarhizium robertsii》有告知。
76.2.2)、再将beas基因下游组合片段和5
’‑
ppk2-bar-gfp质粒用限制性内切酶spei和ecor
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37℃酶切2h以上后使用t4 dna连接酶将两者连接起来；后续操作方法同上述2.1)；即，将连接产物化转至eco.li dh5α感受态细胞，涂布于含20μg/ml卡那霉素(km)的lb平板上，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养一天。随机挑选8株转化子进行菌落pcr鉴定。
77.鉴定引物为bar-down和cc-beas-3-2，体系为2
×
taq plus master mix ii 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o 8μl，上述所用的酶均来自杭州硕盟生物科技有限公司；
78.反应条件为94℃ 1.5min；94℃ 20s,55℃ 20s,72℃ 2min,30个循环；72℃ 5min；结果如图2-2所示：这3、4、6号转化子均有1400bp左右的条带，其余无对应条带为假阳性。
79.因此表明3、4、6号转化子为阳性克隆，调取其中一株进行测序，所得序列与beas基因下游组合片段序列比对存在一致性；
80.结果表明5
’‑
ppk2-bar-gfp与下游片段连接完成并成功转入eco.li dh5α中，该重组质粒命名为5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’。
81.引物序列如下：
82.bar-up：5'-aggcattcattgttgac-3'
83.bar-down：5'-tcagcctgccgggtaccgc-3'。
84.实施例2、根癌农杆菌介导真菌转化
85.1)、于-80℃冰箱中取虫草菌原始菌液，用接种环蘸取菌液于pda固体培养基上划板，活化真菌，28℃恒温培养，培养2周左右。
86.2)、将实施例1所得的重组质粒5
’‑
ppk2-bar-gfp-3’转入agl1农杆菌感受态中，涂
板培养(含20μg/ml km的lb平板，28℃恒温培养箱倒置培养2-3天)。
87.随机挑选8株阳性单菌落，接种到1ml含卡那霉素(km)抗生素的lb液体培养基中，于摇床中(28℃，250rpm)培养16～20h，进行菌液pcr鉴定。
88.鉴定引物为cc-beas-5-1和bar-up，体系为2
×
taq plus master mix ii 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，菌液1μl，ddh2o 7μl，上述所用的酶均来自杭州硕盟生物科技有限公司。
89.反应条件为94℃ 1.5min；94℃ 20s,55℃ 20s,72℃ 2min,30个循环；72℃ 5min；
90.结果如图3所示：验证所得2号农杆菌有1300bp左右的条带，表面该阳性单菌落敲除载体质粒已转入农杆菌中，其余7株无对应条带为假阳性。
91.判定质粒已转入农杆菌中；将此农杆菌agl1阳性单菌落扩大培养，接种到4ml含卡那霉素(km)抗生素的lb液体培养基中，于摇床中(28℃，250rpm)培养16～20h，取1ml菌液与相应体积的50％甘油混合，于-80℃保菌。
92.3)、挑取上述步骤2)所得的农杆菌agl1阳性单菌落，接种到10ml含卡那霉素(km)抗生素的lb液体培养基中，于摇床中(28℃，250rpm)培养16～20h,直到od660达到1.0～1.5；用含40mm mes的induction medium(imas solution)和200μl的10mm acetosyringone(as)将菌液稀释到od660为0.15，于摇床中(28℃，250rpm)培养至od660达到0.4～0.5(约4h)；得农杆菌诱导培养液。
93.含40mm mes的imas solution为：400ml
·
l-1 2.5
×
mm salts，1.8g
·
l-1glucose，10ml
·
l-1 50％ glycerol，40ml
·
l-1 40mm mes ph5.8。即，配置方法为：要配置100ml imas solution需要40ml 2.5
×
mm salts，0.18g glucose，1ml 50％ glycerol，余量用ddh2o定容至96ml，高温灭菌后，待用时再加入4ml 40mm mes(19.52g to 100ml ddh2o，用5m koh将ph调至5.3，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用。
94.100ml的10mm as的配置方法为：取0.1962g的as溶于ddh2o中，定容为100ml，用5m koh将ph调至8，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃避光冻存备用。
95.4)、从上述步骤1)所得生长成熟蝉花虫草菌菌丝体，取50ml ep管中加入16ml 0.05％triton-x-100(v/v)，将3个平板的真菌菌丝铲出，涡旋仪震荡，用加玻璃棉的枪头过滤上述液体，得到孢子悬液，取25μl孢子悬液+975μl 0.05％triton于1.5mlep管中混匀，显微镜下数孢子。用含40mm mes和200μm as的imas液体培养基将其梯度稀释为1
×
106个孢子/ml(注意避光)。
96.5)、取步骤4)所得的100μl稀释后的孢子悬液与等体积的步骤3)所得的农杆菌诱导培养液1:1混合，用枪轻轻吹打混匀，均匀涂布于铺有黑色无菌滤纸(neumann,germany)的含40mm mes和200μm as的induction medium plates(imas plates)上，于28℃恒温培养箱中将平板正置培养2天；
97.含40mm mes和200μm as的imas plates为：400ml
·
l-1 2.5
×
mm salts，0.9g
·
l-1 glucose，10ml
·
l-1 50％ glycerol，15g
·
l-1agar，40ml
·
l-1 40mm mes ph5.8，20ml 10mm as。即，配置方法为：要配置100ml imas plates需要40ml 2.5
×
mm salts，0.09g glucose，1ml 50％ glycerol，余量用ddh2o定容至94ml，高温灭菌后，倒板时加入4ml 40mm mes(19.52g to 100ml ddh2o，用5m koh将ph调至5.3，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用)和2ml 10mm as
98.10mm as的配置方法为：0.1962g to 100ml ddh2o，用5m koh将ph调至8，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃避光冻存备用。
99.将诱导培养基中已长出白色绒毛状菌丝的黑色滤纸转移到m-100筛选培养基平板上(含400μg/ml cefotaxime和300μg/ml ppt抗生素)，接着在黑色滤纸上方再倒入12ml～14ml含有相应抗生素的m-100筛选培养基形成三明治模型(即，黑色滤纸的两侧都是m-100筛选培养基)，待m-100筛选培养基凝固后，于28℃恒温培养箱中倒置平板培养5～10天；将转化子用牙签挑取到含相同浓度抗生素的m-100筛选培养基上进行二次筛选，于28℃恒温培养箱中倒置平板培养2天左右；
100.若挑选的转化子能够在二次筛选的m-100筛选培养基上再次生长，将能够再次生长的转化子转移到pda培养基上倒置培养(28℃恒温培养)，3～5天后通过pcr进一步筛选，从而最终确定阳性转化子，筛选方法具体见下述实施例3。
101.m-100筛选培养基上(含400μg/ml cefotaxime和300μg/ml ppt抗生素)：62.5ml
·
l-1 m-100salt solution，10g
·
l-1 glucose，3g
·
l-1 kno3，15g
·
l-1 agar；2ml
·
l-1 200mg/ml cef，1.5ml
·
l-1 200mg/ml ppt；
102.m-100salt solution(1l)配制方法：kh2po4 16g，na2so4 4g，kcl 8g，mgso4.7h2o 2g，cacl2 1g，m-100trace element solution 8ml；
103.m-100trace element solution(500ml)配置方法：h3bo3 30mg，mncl2
.
4h2o 70mg，zncl2 200mg，na2moo4
.
2h2o 20mg，fecl3
.
6h2o 50mg，cuso4
.
5h2o 200mg。
104.实施例3、两组pcr验证阳性转化子
105.第一步pcr验证：
[0106]“no”验证，选取可在pda平板上再次生长的可能的阳性转化子，挑取少许菌丝为模板，以目的基因内部片段截取一段为上游引物(cf-1)，以目的基因下游片段后100bp左右截取一段为下游引物(cf-2)，进行验证，设置阴性对照组即以蝉花真菌野生型菌株菌丝为模板，pcr体系为：kod fx dna polymerase 0.4μl，2mm dntps 4μl，2
×
pcr buffer for kod fx 10μl，ddh2o 4.4μl，cf-1 0.6μl、cf-2 0.6μl；上述所用的酶均来自杭州硕盟生物科技有限公司。
[0107]
扩增条件为94℃ 5min，98℃ 10s，56℃ 45s，68℃ 2min，30个循环；68℃ 5min；将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0108]
上游引物(cf-1)：gactggctgatggccac
[0109]
下游引物(cf-2)：gagaagtcgcggtactg
[0110]
选择10株转化子pcr验证，结果应为野生型对照组有1639bp的目的条带，实验组无目的条带，实际结果如图4所示：野生型对照组有目的条带，3、5号转化子均无1639bp的条带。
[0111]
上述敲除突变株后验证片段(1639bp的目的条带)如seq id no:4所述。
[0112]
第二步pcr验证：
[0113]“no”和“yes”验证，选取第一步pcr验证中可能的阳性转化子3、5号，挑取少许菌丝为模板，以bar-down为上游引物，以cf-2为下游引物，进行“yes”验证，以cf-1为上游引物，以cf-2为下游引物，进行“no”验证，设置阴性对照组即以野生型菌株菌丝为模板，pcr体系为：
[0114]“yes”验证：kod fx dna polymerase 0.4μl，2mm dntps 4μl，2
×
pcr buffer for kod fx 10μl，ddh2o 4.4μl，cf-2 0.6μl、bar-down 0.6μl；
[0115]“no”验证：kod fx dna polymerase 0.4μl，2mm dntps 4μl，2
×
pcr buffer for kod fx 10μl，ddh2o 4.4μl，cf-1 0.6μl、cf-2 0.6μl；上述所用的酶均来自杭州硕盟生物科技有限公司。
[0116]
扩增条件为94℃ 5min，98℃ 10s，56℃ 45s，68℃ 2min，30个循环；68℃ 5min；将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0117]“yes”结果应为野生型对照组无目的条带，实验组有约1500bp目的条带，结果如图5的1、2、3泳道所示：野生型无目的条带，3、5号转化子均有约1500bp的条带。
[0118]
上述敲除突变株“yes”验证片段(约1500bp的目的条带)如seq id no:5所述。
[0119]“no”结果应为野生型对照组有1639bp的目的条带，实验组无目的条带，结果如图5的4、5、6泳道所示：野生型有目的条带，3、5号转化子均无1639bp的条带。
[0120]
上述敲除突变株“no”验证片段(1639bp的目的条带)如seq id no:4所述。
[0121]
即，判断方式为：当“yes”结果为野生型对照组无目的条带，实验组有目的条带，而“no”结果为野生型对照组有目的条带，实验组无目的条带时，判定为目的基因片段已敲除；反之，当第一步验证“no”结果为野生型对照组有目的条带，实验组也有目的条带时，则判定敲除失败。
[0122]
结果表明3、5号转化子均为阳性突变株。
[0123]
实施例4、将实施例3所得的阳性突变株于pda培养基中28℃恒温培养24天，收获的子实体或菌丝进行hplc高效液相色谱法检测其白僵菌素含量。
[0124]
hplc检测子实体中的白僵菌素含量所得的液相色谱图；结果如图6所示；
[0125]
图6-1为标品图；图6-2为3号突变株进样检测图，2个平行；图6-3为5号突变株进样检测图，2个平行。如图6所示两个突变株不产白僵菌素或白僵菌素含量极低。
[0126]
白僵菌素为毒素，本发明所得的蝉花真菌的阳性突变菌株不产白僵菌素或白僵菌素含量极低，因此本发明为针对不产生白僵菌素的蝉花虫草真菌的新药开发提供基础。