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农杆菌K599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法

来源：花匠小妙招时间：2025-10-14 20:29

本发明属于中药材遗传转化体系研究领域，旨在提供一种发根农杆菌k599介导的稳定的金银花遗传转化体系建立的具体方法。

背景技术：

1、金银花(lonicera japonica thunb.)为具有清热解毒、疏风散热的传统常用中药，广泛用于中医临床配方和中成药。金银花人工引种种植的历时已久，在我国山东、河南、河北等省份都有较大的种植面积。目前金银花的种植根据药用或者观赏等种植目的不同，选育出的品种有大毛花、树四季花、金花三号，北花一号等。相对于金银花在药用级园艺观赏领用越来越广泛的应用，其对优良品种的需求远超其良种的选育过程。而且，现有种植模式下，种质混杂以及退化的现象亦是非常严重。选种、育种过程中缺乏稳定的遗产转化体系，是导致金银花新品种选育工作进展十分缓慢的主要原因之一。

2、发根农杆菌是根瘤菌科农杆菌属的一种革兰氏阴性土壤细菌，具有感染能力强，感染范围广的优良特点。k599发根农杆菌含有pri2659农杆型ri质粒，具有广泛的宿主范围，大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物都能成为其宿主，同时具有链霉素抗性。发根农杆菌侵染植物外植体能诱导产生转基因毛状不定根，获得的毛状根起源于单细胞而无嵌合体，并能在无植物激素的培养基上自主性快速生长。可以作为生物反应器，用于生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物活性成分。

3、本发明即是基于现有技术的不足，提供了一种利用农杆菌k599为介导载体，制备具有稳转性能的金银花遗传转化体系的组织培养方法。发明采用幼嫩的金银花茎作为外植体，经携带目的基因的k599农杆菌菌液侵染，诱导产生携带目的基因的不定根遗传转化体系或者携带目的基因的金银花新植株。所建立的遗传转化体系，能够为选育金银花优良新品种、提升其品质提供一种重要的技术手段。

技术实现思路

1、本发明的目的是通过以金银花茎段作为外植体被携带目的基因的农杆菌侵染通过组织培养从而产生不定根，提供一种基于组织培养的金银花遗传转化方法。本发明通过发根农杆菌k599诱导金银花产生不定根，为优化金银花的遗传转化体系建设奠定良好的技术支撑。

2、为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一种农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，该方法包括以下步骤：

4、s1、将携带有gus报告基因质粒的农杆菌k599菌株均匀涂抹在ty固体培养基上，倒置活化培养；然后挑取单菌落接种于ty液体培养基中振荡培养活化后，进一步将活化后的菌液接种于ty液体培养基中培养至菌液的od600值处于0.6～0.8之间，再将菌液重悬于mes缓冲液中得到mes侵染液；

5、s2、切取金银花植株的茎作为外植体，清洗干净且充分消毒后下端切口浸泡在所述mes侵染液中进行侵染，随后转移到生长培养基中暗培养；

6、s3、将暗培养后的所述茎段转移到含有抗生素的培养基中培养至长出不定根，将不定根切割后转移至生长培养基中扩大培养。

7、作为优选，若所述茎段在含有抗生素的培养基没有长出不定根，则将其转移生根培养基中加速诱导生根。

8、作为优选，所述外植体优选为金银花植株上健康并带有叶芽的嫩茎。

9、作为优选，所述gus报告基因质粒上预先连接需要导入金银花基因组的外源目标基因。。

10、作为优选，所述外植体的消毒采用75％乙醇溶液和15％次氯酸钠溶液交替浸泡的消毒方法。

11、作为优选，所述ty液体培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)5g/l+酵母提取物(yeast extract)3g/l+1m的氯化钙10ml/l。

12、作为优选，所述ty固体培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)5g/l+酵母提取物(yeast extract)3g/l+1m的氯化钙10ml/l+琼脂粉15g/l。

13、作为优选，所述mes缓冲液的配方为：ms培养基4.47g/l+1m mes10ml/l+1m mgcl210ml/l+200mm as100ul/l。

14、作为优选，所述生长培养基的配方为：1/2ms+蔗糖20.0g/l+琼脂9.3g/l。

15、作为优选，所述含有抗生素的培养基的配方为：1/2ms+蔗糖20.0g/l+琼脂9.3g/l+抗生素400mg/l；所述抗生素优选为头孢噻肟钠。

16、作为优选，所述生根培养基的配方为：1/2ms+naa1.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂9.3g/l+抗生素400mg/l。

17、相对于现有技术而言，本发明实施后可能带来的有益效果如下：

18、本发明方法基于植物主动再生能力与无性繁殖的特点，有望应用于更广泛的植物物种，实现更多特色资源植物和经济作物的性状改良与种质创新，以推动相关领域的基础研究和应用研究发展，为特色植物的高效遗传改良和现代农业育种应用提供理论和方法的支撑。

19、相对比现有技术一般采用升汞配合次氯酸钠溶液对外植体消毒的方法，本发明在多次试验验证的基础上，采用次氯酸钠及75％乙醇依次浸泡、冲洗的方法，能够更充分地实现对金银花外植体的消毒，从而避免外界的病原体对于外植体及后续组培环节的污染。

20、相较于植物形成愈伤组织再脱分化生成不定根，本发明极大的缩短了培育时间，为快速改良金银花品种、提升药材品质提供一种重要的技术手段。

技术特征：

1.一种农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，若所述茎段在含有抗生素的培养基没有长出不定根，则将其转移生根培养基中加速诱导生根。

3.如权利要求1或2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述gus报告基因质粒上预先连接需要导入金银花基因组的外源目标基因。

4.如权利要求1或2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述外植体的消毒采用75％乙醇溶液和15％次氯酸钠溶液交替浸泡的消毒方法。

5.如权利要求1或2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述ty液体培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)5g/l+酵母提取物(yeast extract)3g/l+1m的氯化钙10ml/l。

6.如权利要求1或2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述ty固体培养基的配方为：胰蛋白胨(tryptone)5g/l+酵母提取物(yeast extract)3g/l+1m的氯化钙10ml/l+琼脂粉15g/l。

7.如权利要求1或2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述mes缓冲液的配方为：ms培养基4.47g/l+1m mes10ml/l+1m mgcl210ml/l+200mm as100ul/l。

8.如权利要求1或2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述生长培养基的配方为：1/2ms+蔗糖20.0g/l+琼脂9.3g/l。

9.如权利要求1或2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述含有抗生素的培养基的配方为：1/2ms+蔗糖20.0g/l+琼脂9.3g/l+抗生素400mg/l；所述抗生素优选为头孢噻肟钠。

10.如权利要求2所述的农杆菌k599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基的配方为：1/2ms+naa1.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂9.3g/l+抗生素400mg/l。

技术总结
本发明公开了一种农杆菌K599介导的金银花遗传转化体系建立的组织培养方法。该方法用幼嫩的金银花茎作为外植体，经彻底消毒后，侵染携带GUS报告基因的K599农杆菌菌液进行组织培养一定时期，再经农杆菌脱菌后诱导其产生不定根或诱导其产生不定芽。进一步，经抗生素阳性筛选后，将不定根根转移至生根培养基中扩繁，或将不定芽分割后移栽培养成新的金银花植株。本发明的K599农杆菌可以导入编辑所需表型的基因的质粒，再通过上述方法培养，即有望获得所需表型的金银花遗传转化体系。

技术研发人员：郑文茜,李佳晨,吕俊乐,阙若楠,陈婕,杨舒恒,岳治国,杨丙贤,张琳
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/30