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一株假丝酵母及其在滇山茶花发酵中的应用的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-09-16 08:09

本发明属于微生物，具体涉及一株假丝酵母及其在滇山茶花发酵中的应用。

背景技术：

1、滇山茶是一种原产于中国的山茶科山茶属植物，主要生长于海拔1500-2800米的山地阔叶林或混交林中，在云南地区广泛分布。《云南中草药》和《中药大辞典》等医学典籍记载显示，滇山茶可供药用，有诸多有利的功效。同时，目前也有一些研究利用不同的生化提取工艺，研究滇山茶不同部位如滇山茶叶、花的提取物的功效活性。

2、微生物技术的应用逐渐在功效护肤品原料的开发中占据一席之地，大量研究证明发酵有提升植物原料中活性物质、强化植物原料功效的效果，同时利用微生物发酵提取还具备节能减排、降低污染的特点，一些情况下还能减少植物原料不利的毒性物质。因此，也有一些研究尝试用微生物发酵手段进行山茶花生物提取。目前山茶花发酵领域主要存在两大技术路线：第一种是复合菌种发酵，该过程往往需添加外源营养物质（如葡萄糖、蛋白胨等）并采用多阶段发酵工艺，如中国专利cn115569096b和中国专利cn119318609a。前者（中国专利cn115569096b）公开了一种山茶花发酵滤液及发酵工艺，通过使用乳酸菌群发酵山茶花且外源添加碳源、维生素、无机盐、低聚果糖的工艺，得到富含茶多酚、总黄酮及小分子天然营养物质等的山茶花发酵滤液。后者（中国专利cn119318609a）公开了一种山茶花发酵物及其制备方法和应用，先以崩溃酶酶解山茶花，再使用复合酵母种子液（洛格酵母和克鲁斯假丝酵母）发酵，且外源添加碳源、氮源、生物碱、磷酸盐、铵盐和酸度调节剂，得到一种具有修护、舒缓和控油功效的山茶花发酵物。然而，类似技术因多阶段发酵工艺导致生产成本提高，且复合菌种存在代谢产物不可控风险。第二种山茶花发酵领域的技术路线是以单一的常见酵母进行发酵，如中国专利cn116785361a。其以酿酒酵母发酵山茶花，得到了一种具有淡化皱纹和抗皮脂功效的山茶花发酵滤液。虽然技术工艺得到简化，但其菌株酿酒酵母是一种广泛应用且特性较为熟知的菌株、且来源于常规工业菌种库，缺乏独特性和创新性。另外，现有的发酵山茶花的研究主要聚焦保湿、抗氧化、抗皱和亮肤等功效，但缺乏对于抗糖化以及细胞层面抗衰功效的挖掘。

3、由以上可知，目前的山茶花发酵工艺专利均未涉及特殊生态环境来源的功能菌株，缺少能特异性提升云南特有滇山茶花功效特性的菌株，也没有提升滇山茶花抗糖化及细胞衰老协同作用机制的工艺技术。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种由云南野生大型食用真菌中分离纯化的特殊假丝酵母菌株( candida railenensis)，并根据该菌株的生物特性设计一种简化的滇山茶花发酵工艺，由该假丝酵母菌株发酵提取滇山茶花得到的发酵滤液。通过本发明，旨在提供一种安全、环保、经济，且具有增益效果（抗糖化及细胞衰老）的滇山茶花微生物提取方法，实现以微生物发酵手段提取得到富含滇山茶花活性成分的滤液，同时丰富滇山茶花原本的功能效果。

2、本发明的创新之处在于首次提供一株由云南大型野生食用真菌中分离纯化的假丝酵母菌株( candida railenensis)，并且基于该菌株特异性设计一种针对性的生物发酵工艺；在该发酵工艺下这株假丝酵母菌株能提升滇山茶花原有的抗氧化、抗糖化以及抗衰活性，最终的滇山茶花发酵提取物可以作为功效原料应用于化妆品领域。

3、本发明提供了如下技术方案：

4、第一方面，本发明提供了一株由云南野生食用菌（白牛肝菌）分离得到的假丝酵母，该假丝酵母的菌株编号为btn-hb-m5（下述简称为m5），分类命名为 candida railenensis，保藏时间为2024年9月20日。保藏单位是在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：65164。

5、优选的，假丝酵母的its序列如序列表seq no:1所示。

6、优选的，在本发明中，假丝酵母m5菌株的具体获取方式如下所示：

7、（1）选取生长于云南的野生白牛肝菌样本，清洗后以无菌水于4℃下浸泡18h~24h后，吸取适当浸泡液涂布在ypd固体培养基上，以25℃~37℃培养24h~30h后，在ypd固体培养基上挑取出不同形态的菌落，在ypd固体培养基表面划线纯化；

8、（2）在显微镜下观察纯化后不同平板上的单菌落，挑选具有酵母形态的不同菌株进行鉴定，同时对所选菌株进行保藏。

9、第二方面，本发明提供了一种发酵后的滇山茶花浆，使用保藏编号为gdmcc no：65164的假丝酵母作为发酵菌，发酵滇山茶花得到。

10、第三方面，本发明提供了一种滇山茶花发酵提取物，使用保藏编号为gdmcc no：65164的假丝酵母作为发酵菌，发酵滇山茶花得到发酵后的滇山茶花浆，将发酵后的滇山茶花浆过滤得到滇山茶花发酵提取物。该滇山茶花发酵提取物亦称为滇山茶花发酵滤液。该滇山茶花发酵提取物为单一假丝酵母发酵产物，可用于食品、日化产品中，进一步提升并丰富滇山茶花的护肤功效，无其他额外成分添加，无刺激性副产物，可在日化产品中应用。该滇山茶花发酵提取物具有优越的抗氧化、抗糖化和抗衰作用，能明显通过抗氧化缓解皮肤衰老指标，在日化产品领域有极大的应用前景。

11、第四方面，本发明提供了一种滇山茶花发酵提取物的制备方法，包括如下步骤：

12、步骤s1，将保藏编号为gdmcc no：65164的假丝酵母接入ypd液体培养基进行活化，得到假丝酵母m5的菌株种子液；

13、步骤s2，将菌株种子液以1%~3%接种量接种于滇山茶花发酵培养基进行发酵提取，得到发酵后的滇山茶花浆；

14、步骤s3，将发酵后的滇山茶花浆先离心，去除固体残渣、菌体等不溶物，离心后取上清液，并将该上清液过滤，得到以微生物手段制备的滇山茶花发酵提取物。

15、优选的，步骤s1中，将保藏的假丝酵母m5在ypd平板上进行画线，以25℃~37℃培养24 h后完成菌株复苏；从复苏的假丝酵母m5平板上挑取单菌落接入ypd液体培养基进行活化，活化时以25℃~30℃培养18 h~24 h，活化1~2代得到假丝酵母m5的菌株种子液。

16、优选的，步骤s2中，发酵温度为25℃~37℃，发酵时间为24 h~48 h，同时设置摇床培养的转速为150 rpm~200 rpm。

17、优选的，步骤s3中，离心条件为5000rpm~8000rpm，离心时间为15 min~30 min；随后将离心得到的上清液以0.22 μm的滤膜过滤，得到滇山茶花发酵提取物。

18、优选的，滇山茶花发酵培养基的制备方法为：选取滇山茶花作为原料，粉碎处理；然后以5%质量百分的添加量在超纯水中加入滇山茶花粉末，以121℃，蒸汽灭菌20 min得到。

19、第五方面，本发明提供了上述滇山茶花发酵提取物在日化产品中作为抗氧化、抗糖化和抗衰老成分。

20、第六方面，本发明提供了一种包含上述的滇山茶花发酵提取物的日化产品。

21、优选的，滇山茶花发酵提取物在日化产品中的添加量按体积比为3%。经实验验证，该添加量下安全无毒且功效显著。

22、优选的，日化产品可以是各种类型，例如洗发水、护发产品、化妆品等。

23、优选的，化妆品可以为化妆水、护肤膏霜、护肤乳液、护肤精华液、眼霜、面膜、卸妆油、洗面奶、沐浴露、洗发水等。

24、与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

25、1、本发明通过筛选得到了一种适合对滇山茶花进行发酵的酵母菌——假丝酵母btn-hb-m5（简称m5），使用该菌株对滇山茶花进行生物发酵，该菌株能特异性提升滇山茶花功效，填补了目前滇山茶花发酵提取技术未涉及特殊生态环境来源的菌株的空缺。

26、2.本发明利用假丝酵母btn-hb-m5经过适合的培养、收集工艺能够得到滇山茶花发酵提取物（发酵滤液），整体发酵工艺绿色高效；制备的滇山茶花发酵提取物能够体外清除dpph自由基和清除abts自由基的能力、抑制透明质酸酶的活性、抑制ages生成，具有良好的体外抗糖化、抗氧化和抗衰的功效活性，同时具有安全性，可广泛应用于化妆品领域。

27、3.本发明使用假丝酵母m5对滇山茶花进行发酵后，提升了滇山茶花在抗氧化、抗糖化和抗衰方面的功效，因此可以加强其在日化产品中使用的功效，使产品具有更高的性能：

28、1）以假丝酵母m5制备的滇山茶花发酵提取物与滇山茶花未发酵提取物相比，dpph清除率提升11.96%；

29、2）以假丝酵母m5制备的滇山茶花发酵提取物与滇山茶花未发酵提取物相比，abts清除率提升6.46%；

30、3）以假丝酵母m5制备的滇山茶花发酵提取物与滇山茶花未发酵提取物相比，透明质酸酶抑制率提升32.06%；

31、4）以假丝酵母m5制备的滇山茶花发酵提取物与滇山茶花未发酵提取物相比，ages抑制率提升13.20%；

32、5）以假丝酵母m5制备的滇山茶花发酵提取物与滇山茶花未发酵提取物相比，对皮肤成纤维细胞的促生长效果更显著，3%（v/v）的假丝酵母m5滇山茶花发酵提取物干预后皮肤成纤维细胞活力达到105.99%；

33、6）在3%添加量下，以假丝酵母m5制备的滇山茶花发酵提取物与滇山茶花未发酵提取物相比，在h2o2衰老模型下皮肤成纤维细胞中mmp3 mrna的表达量显著降低46.53%。

34、本发明的制备方法操作简便，操作过程经济、绿色、无污染，所用装置都易于清洗，同时发酵手段增强了滇山茶花提取物的功效活性，在体外皮肤细胞实验中也无毒性并有良好的表现，这些特点均表明了该技术不仅适用于规模化工业生产，在护肤品原料开发也具有巨大潜力。