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一种山茶花发酵滤液及发酵工艺的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2024-12-19 06:34

一种山茶花发酵滤液及发酵工艺的制作方法

1.本发明涉及植物发酵液领域，具体涉及一种山茶花发酵滤液及发酵工艺。

背景技术：

2.山茶(camellia japonica linn.)，俗称山茶花，古名海石榴，隶属于山茶科(theaceae)山茶属(camellia)自三国时代有记载的山茶栽培以来，山茶花在我国已经有1800多年的栽培历史，我国是世界上最早将茶花作为观赏植物的国家。其中，红山茶作为我国山茶属的特有种，它是一种优良的红山茶种，具有观赏、油用、药用价值。
3.红山茶花中蕴含的黄酮、多酚等成分都比国外的红山茶花含量高。更有相关数据进一步指出，在中国高山上生长的红山茶花所含的多酚含量超过5％，黄酮含量超过了7％；其他活性物质含量高10％左右，不仅具有观赏价值，而且护肤价值也更为高，传统的工艺方法多数都要通过酸碱、酶、超声等处理山茶花，再经过有机溶液萃取提纯得到，但这些方法会影响总多酚的组成和结构，并且不利于山茶花再护肤以及药用方面的应用。
4.现有技术中专利号为cn202110877216.6的文件中公开了一种用于山茶花多酚的提取方法，采用由丙酮、生物酶、冰醋酸和水制得的提取液和吸附剂提取山茶花中的多酚，并用饱和正丁醇和乙酸乙酯进行萃取，再经过浓缩干燥制得；专利号为cn201710612581.8的文件中公开了一种种西南山茶花中茶多酚的制备方法，该方法以干燥的西南山茶花为原料，以50～80％的丙酮水溶液为溶剂进行回流提取，提取液浓缩干燥后转溶于水、过滤，滤液经dm130大孔树脂吸附后，用蒸馏水洗脱杂质，再以浓度为20～60％乙醇溶液洗脱，采集乙醇脱液，浓缩干燥后得西南山茶花的茶多酚产品。
5.上述方法中均使用有机溶剂，以及蒸馏萃取的方法来提取山茶花中的多酚，最终制得产品中往往含有部分有机溶剂，不利于后续在化妆品等方面的应用。

技术实现要素：

6.基于此，本技术通过提供一种山茶花发酵滤液及发酵工艺，通过使用乳酸菌群发酵工艺的方式，降解产生更多小分子活性成分，得到富含茶多酚、总黄酮及小分子天然营养物质等的发酵滤液，可迅速渗透肌底，显著改善细纹与毛孔，提升肌肤弹性，抵御并修护肌肤初老，并且制备过程中不使用有机溶剂，安全环保，应用性更强。
7.本发明第一个方面提供了一种山茶花发酵滤液，制备原料包括：山茶花，乳酸菌，低聚果糖和水。
8.在一些优选的方案中，所述乳酸菌的接种量是山茶花的0.5-5倍。
9.进一步优选的，所述乳酸菌的接种量是山茶花的0.83倍。
10.本发明采用乳酸菌的接种量是山茶花的0.83倍，保证了山茶花滤液中活性物质的含量及纯度。本技术人推测：当乳酸菌的接种量过大时，会使得体系中的营养物质消耗过快，同时产生大量的副产物，导致部分乳酸菌因缺乏能量而生长受限，提前进入衰亡期，当接种量过少时，乳酸菌繁殖基数少，发酵效果低，发酵液中产生的活性物质少，降低了山茶
花发酵液的功效。本技术人通过实验发现，当乳酸菌接种量是山茶花的0.83倍时，制得的山茶花滤液抗氧化性能最强。
11.在一些优选的方案中，所述乳酸菌选自乳杆菌、双岐杆菌、嗜热链球菌中的至少一种。
12.进一步优选的，所述乳杆菌的组成按重量份计，包括：植物乳杆菌1-2份、副干酪乳杆菌2-4份、鼠李糖乳杆菌1-2份、嗜酸乳杆菌1-2份。
13.本技术采用乳杆菌作为发酵的菌种，并且调控了其组成及比例，使得在发酵过程中产生含量高，纯度好的多酚和黄酮，提高了山茶花滤液的抗氧化能力和抗衰能力。本技术人推测：乳杆菌发酵能够促进生物活性物质的释放，从而提高其生物活性，并且植物乳杆菌发酵产生的某些特殊酶类如蛋白酶、淀粉酶等可将山茶花中的结合态多酚水解成游离态，同时乳杆菌在发酵过程中具有一定的抑菌作用，保证了山茶花滤液的纯度。
14.在一些优选的方案中，所述山茶花选自花蕾期的红山茶花、盛花期的红山茶花、落花期的红山茶中的至少一种。
15.进一步优选的，所述山茶花为花蕾期的红山茶花。
16.本发明采用花蕾期的红山茶花，保证了发酵的山茶花滤液具有更优异的抗氧化和抗炎效果。本技术人推测为：花蕾期的红山茶花花卉的胚囊、花粉囊逐渐形成，内部含有丰富的营养物质，使得在发酵工艺中经过乳酸菌降解会产生更为丰富的多酚、黄酮等小分子活性物质，制得的发酵滤液具有优异的抗氧化和抗炎效果。
17.在一些优选的方案中，所述山茶花的产地选自浙江大垟山、云南腾冲中的至少一种。
18.进一步优选的，所述山茶花的产地为浙江大垟山。
19.本发明采用浙江大垟山生产的红山茶花，使得制备的山茶花发酵液抗氧化能力最强。本人推测为：山茶花惧风喜阳，喜欢生长在地势高爽，空气流通，温暖湿润的地方，浙江大垟山地区平均海拔在800米以上，光照充足，土壤肥沃，年平均温度在14℃以下，适宜山茶花的生长，此地的山茶花富含更多的活性小分子物质，经过乳酸菌发酵后的提取液具有较强的抗氧化能力、dpph
·
清除能力和羟基自由基清除能力。
20.进一步优选的，所述山茶花粉碎过40-80目筛。
21.在一些优选的方案中，所述山茶花发酵滤液，制备原料还包括：碳源、维生素、无机盐和防腐剂。
22.在一些优选的方案中，所述维生素选自维生素b族、维生素h、维生素e中的至少一种。
23.进一步优选的，所述维生素为维生素b族。
24.在一些优选的方案中，所述碳源选自单糖源、双糖源、多糖源、甘油、小分子醇、无机碳源中的至少一种。
25.在一些优选的方案中，所述单糖源为葡萄糖、果糖、半乳糖、甘油、小分子醇、无机碳源中的至少一种。
26.进一步优选的，所述碳源为葡萄糖。
27.在一些优选的方案中，所述无机盐为氯化钠。
28.在一些优选的方案中，所述防腐剂选自对羟基苯乙酮和1,2-己二醇中的至少一
种。
29.在一些优选的方案中，所述山茶花、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖和水的重量份之比为(2-10)：(2-8)：(0.2-1)：(0.5-1)：(0.1-0.5)：(70-85)。
30.本发明第二个方面提供了一种山茶花发酵滤液的发酵工艺，包括以下步骤：
31.(1)山茶花粉碎过筛，得到山茶花细粉；
32.(2)将山茶花、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、水混合均匀，高压灭菌后，得到灭菌培养基，冷却备用；
33.(3)将乳酸菌扩大培养，得到二级种子液；
34.(4)将二级种子液转接到灭菌培养基中，在33
±
1℃条件下恒温培养发酵，以120-200r/min的搅拌速度摇床培养24～72小时，得到发酵液；
35.(5)发酵液高温处理后，加入防腐剂，混合均匀，得到山茶花发酵滤液。
36.在一些优选的方案中，所述步骤(3)的具体过程如下：将乳酸菌转接于mrs(de man rogosa sharpe)液体培养基中，在33
±
1℃下静置培养，得到一级种子液，再将一级种子液在mrs液体培养基中扩大培养，33
±
1℃下静置培养12-18小时，得到二级种子液。
37.在一些优选的方案中，所述步骤(5)的具体过程如下：发酵液进行第一次高温处理，冷却后进行超声，得到处理发酵液，再进行10um孔径滤板过滤去渣，得到澄清液体，澄清液体进行第二次高温处理，冷却后加入防腐剂，得到山茶花发酵滤液。
38.进一步优选的，所述第一次高温处理的处理温度为70-80℃。
39.进一步优选的，所述第二次高温处理的处理温度为80-90℃。
40.在本技术中，通过对发酵液进行两次高温处理，可以准确控制发酵的时间，确保了发酵液中茶多酚，总黄酮等生物小分子天然营养物质的含量和单一性，保证了山茶花发酵液的抗氧化性和自由基清除能力。本技术人推测：在第一次以70-80℃的温度处理山茶花发酵液后进行超声处理，可以迅速地使加入的乳酸菌失活，防止因发酵时间过长而产生酸性物质，影响山茶花发酵液的功效，第二次高温处理可以对发酵液进一步的纯化，并且消灭在制备过程可能滋生或掺入的微生物群，保证制得发酵液处于无菌环境，使发酵液具有一定的安全性和使用寿命。
41.在一些优选的方案中，所述步骤(4)中摇床培养时间为36小时。
42.本发明采用摇床培养时间为36小时，控制了乳酸菌发酵产生的活性物质的量及发酵的完全程度，保证了山茶花发酵液的功效。本技术人推测:发酵时间过长，虽然能使菌种充分生长、发酵，而对于乳酸菌来说，发酵时间过长又会使发酵液中产过多的酸类物质，酸度太高同样影响产品的品质；相反若发酵时间过短的话，则会使得菌种发酵不充分，发酵液中活性物质少，功效下降。
43.本发明第三个方面提供了一种山茶花发酵液在精华乳中的应用，所述山茶花发酵液在精华乳中的添加量为5-10wt％；进一步优选为0.1-10wt％。
44.在一些优选的方案中，所述精华乳按重量份计，包括：去离子水70-76份，甘油3-5份，丙二醇3-5份，聚丙烯酸钠0.01-0.1份，carbopol uitrez 21 0.1-0.3份，olivem 1000 0.3-0.8份，聚二甲基硅氧烷0.1-0.5份，辛酸/癸酸甘油三酯0.1-1份，三乙醇胺0.1-0.3份，nmf-50氨基酸保湿剂1-5份，1，2-乙二醇0.2-1份，对羟基苯乙酮0.1-1份，uv repair二裂酵母溶胞物1-10份，山茶花发酵液1-10份，芽孢杆菌发酵产物0.1-1份。
45.有益效果：
46.(1)本发明采用乳酸菌的接种量是山茶花的0.83倍，保证了山茶花滤液中活性物质的含量及纯度。
47.(2)本技术采用乳杆菌作为发酵的菌种，并且调控了其组成及比例，使得在发酵过程中产生含量高，纯度好的多酚和黄酮，提高了山茶花滤液的抗氧化能力和抗衰能力。
48.(3)本发明采用浙江大垟山生产的红山茶花，该地的山茶花具高含量的总多酚、总黄酮和总多糖，使得制备的山茶花发酵液抗氧化能力最强。
49.(4)本技术通过采用花蕾期的红山茶花，保证了山茶花发酵液中小分子活性物质的含量。
50.(5)在本技术中，通过对发酵液进行两次高温处理，可以准确控制发酵的时间，确保了发酵液中茶多酚，总黄酮等生物小分子天然营养物质的含量和单一性，保证了山茶花发酵液的抗氧化性和自由基清除能力。
51.(6)本技术将发酵温度控制在33
±
1℃，使得乳酸菌的活性保持最高，降解山茶花蕾产生更多的小分子活性成分，得到的发酵液抗氧化效果最佳。
52.(7)本发明采用摇床培养时间为36小时，控制了乳酸菌发酵产生的活性物质的量及发酵的完全程度，保证了山茶花发酵液的功效。
53.(8)本发明中通过加入一定比例的低聚果糖，使制得的山茶花发酵液具有保湿性和抗炎性，更易添加在化妆品中。
54.(9)本发明工艺原料简单安全，生产过程中不使用有机溶剂，应用性强，制得的山茶花发酵滤液不同于市面上的产品大多呈深棕色，而是透明微黄色，杂质少纯度高。
附图说明
55.图1为制得的山茶花滤液实物图；
56.图2为实施例1山茶花发酵滤液对dpph
·
以及羟基自由基浓度的影响水平图；
57.图3为实施例1山茶花发酵滤液对培养的正常人真皮成纤维细胞内的活性氧(ros)浓度的影响水平图；
58.图4为使用实施例1山茶花发酵滤液28天前后胶原蛋白iii(密度)的合成模型对比图；
59.图5为志愿者使用实施例5％山茶花发酵液的山茶花精华乳28天前后眼部皱纹对比图；
60.图6为志愿者使用实施例5wt％山茶花发酵液的山茶花精华乳28天前后皮肤紧实度以及细纹改善程度图；
61.图7为志愿者使用实施例5wt％和10wt％山茶花发酵液的山茶花精华乳28天前后皮肤净弹性改善程度。
具体实施方式
62.实施例1
63.本实施例第一个方面提供了一种山茶花发酵滤液，制备原料包括：花蕾期的红山茶花、乳杆菌(lactobacillus)、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、防腐剂和水，重量比为6：
5：6：0.7：0.7：0.7：0.1：79，其中乳杆菌为乳杆菌二级种子液。
64.所述乳杆菌的组成按重量份计，包括：植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)1.5份、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)3份、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)1.5份、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)1.5份。
65.所述植物乳杆菌购自山东鑫博瑞生物科技有限公司，型号为002。
66.所述副干酪乳杆菌购自西安兰杉生物科技有限公司，货号为ls-01-75。
67.所述鼠李糖乳杆菌购自山东维昂生物科技有限公司，型号为鼠李糖乳杆菌jylr-005。
68.所述嗜酸乳杆菌购自西安泽郎生物科技有限公司，型号为zl-94816。
69.所述花蕾期的红山茶花的产地选自浙江大垟山。
70.所述维生素为维生素b9。
71.所述碳源为葡萄糖。
72.所述无机盐为氯化钠。
73.所述低聚果糖购自山东百龙创园生物科技股份有限公司，型号为fos-95s。
74.所述防腐剂为对羟基苯乙酮(cas:99-93-4)和1,2-己二醇(cas:6920-22-5)，重量比为1：5。
75.本实施例第二个方面提供了一种山茶花发酵滤液的发酵工艺，包括以下步骤：
76.(1)花蕾期的红山茶花粉碎过筛，得到65目山茶花花蕾细粉；
77.(2)将花蕾期的红山茶花、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、水混合均匀，在102.3℃，103.4kpa下维持30分钟灭菌后，得到灭菌培养基，冷却备用；
78.(3)将乳酸菌转接于150ml mrs液体培养基中，在33
±
1℃下静置培养，得到一级种子液，再将一级种子液在mrs液体培养基中扩大培养，33
±
1℃下静置培养15小时，得到二级种子液；
79.(4)将二级种子液转接到灭菌培养基中，在33
±
1℃条件下恒温培养发酵，以160r/min的搅拌速度摇床培养36小时，得到发酵液；
80.(5)发酵液进行第一次高温处理，处理温度为80℃，保持20分钟，冷却至25℃后进行超声，超声功率为450w，温度为40℃，时间为60分钟，得到处理发酵液，再进行10um孔径滤板过滤去渣，得到澄清液体，澄清液体进行第二次高温处理，处理温度为90℃，保持30分钟，冷却至25℃后加入防腐剂，得到山茶花发酵滤液。
81.所述mrs液体培养基的ph值(25℃)为6.2
±
0.2，组成成分包括(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉5.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，醋酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，琼脂15.0，吐温80 1.0，购自上海联迈生物工程有限公司，编号为：lm0384-5。
82.本实施例第三个方面提供了一种含5wt％山茶花发酵液的山茶花精华乳，其组成按重量份计，包括：去离子水75.65份，甘油(cas:56-81-5)4份，丙二醇(cas:57-55-6)4份，聚丙烯酸钠0.05份，carbopol uitrez 21 0.25份，olivem 1000 0.6份，聚二甲基硅氧烷0.3份，辛酸/癸酸甘油三酯(cas:65381-09-1)0.5份，三乙醇胺(cas:102-71-6)0.25份，nmf-50氨基酸保湿剂3份，1，2-乙二醇(cas:16355-00-3)0.6份，对羟基苯乙酮(cas:99-93-4)0.6份，uv repair二裂酵母溶胞物5份，山茶花发酵液5份，芽孢杆菌发酵产物0.2份。
83.所述聚丙烯酸钠密度(25℃)为1.32g/ml，购自武汉诺梵生物科技有限公司，型号为al225。
84.所述carbopol uitrez 21购自路博润特种化工(上海)有限公司。
85.所述聚二甲基硅氧烷粘度(25℃)为6pa
·
s,购自道康宁(上海)有限公司，型号为mem-0349。
86.所述nmf-50氨基酸保湿剂购自广州优科生物科技有限公司。
87.所述uv repair二裂酵母溶胞物购自广州优科生物科技有限公司。
88.所述芽孢杆菌发酵产物购自广州优科生物科技有限公司，型号为悦适sirelax。
89.对实施例1得到的山茶花发酵滤液进行常规数据检测，如下表1所示。
90.表1
[0091][0092]
实施例2
[0093]
本实施例第一个方面提供了一种山茶花发酵滤液，制备原料包括：花蕾期的红山茶花、乳杆菌(lactobacillus)、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、防腐剂和水，重量比为6：5：6：0.7：0.7：0.7：0.1：79，其中乳杆菌为乳杆菌二级种子液。
[0094]
所述乳杆菌的组成按重量份计，包括：植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)
1.5份、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)3份、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)1.5份、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)1.5份。
[0095]
所述植物乳杆菌购自山东鑫博瑞生物科技有限公司，型号为002。
[0096]
所述副干酪乳杆菌购自西安兰杉生物科技有限公司，货号为ls-01-75。
[0097]
所述鼠李糖乳杆菌购自山东维昂生物科技有限公司，型号为鼠李糖乳杆菌jylr-005。
[0098]
所述嗜酸乳杆菌购自西安泽郎生物科技有限公司，型号为zl-94816。
[0099]
所述花蕾期的红山茶花的产地选自浙江大垟山。
[0100]
所述维生素为维生素b9。
[0101]
所述碳源为葡萄糖。
[0102]
所述无机盐为氯化钠。
[0103]
所述低聚果糖购自山东百龙创园生物科技股份有限公司，型号为fos-95s。
[0104]
所述防腐剂为对羟基苯乙酮(cas:99-93-4)和1,2-己二醇(cas:6920-22-5)，重量比为1：5。
[0105]
本实施例第二个方面提供了一种山茶花发酵滤液的发酵工艺，包括以下步骤：
[0106]
(1)花蕾期的红山茶花粉碎过筛，得到65目山茶花花蕾细粉；
[0107]
(2)将花蕾期的红山茶花、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、水混合均匀，在102.3℃，103.4kpa下维持30分钟灭菌后，得到灭菌培养基，冷却备用；
[0108]
(3)将乳酸菌转接于150mlmrs液体培养基中，在33
±
1℃下静置培养，得到一级种子液，再将一级种子液在mrs液体培养基中扩大培养，33
±
1℃下静置培养15小时，得到二级种子液；
[0109]
(4)将二级种子液转接到灭菌培养基中，在33
±
1℃条件下恒温培养发酵，以160r/min的搅拌速度摇床培养36小时，得到发酵液；
[0110]
(5)发酵液进行第一次高温处理，处理温度为80℃，保持20分钟，冷却至25℃后进行超声，超声功率为450w，温度为40℃，时间为60分钟，得到处理发酵液，再进行10um孔径滤板过滤去渣，得到澄清液体，澄清液体进行第二次高温处理，处理温度为90℃，保持30分钟，冷却至25℃后加入防腐剂，得到山茶花发酵滤液。
[0111]
所述mrs液体培养基的ph值(25℃)为6.2
±
0.2，组成成分包括(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉5.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，醋酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，琼脂15.0，吐温80 1.0，购自上海联迈生物工程有限公司，编号为：lm0384-5。
[0112]
本实施例第三个方面提供了一种含10wt％的山茶花发酵液的山茶花精华乳，其组成按重量份计，包括：去离子水60.65份，甘油4份，丙二醇4份，聚丙烯酸钠0.05份，carbopol uitrez 21 0.25份，olivem 1000 0.6份，聚二甲基硅氧烷0.3份，辛酸/癸酸甘油三酯0.5份，三乙醇胺0.25份，nmf-50氨基酸保湿剂3份，1，2-乙二醇0.6份，对羟基苯乙酮0.6份，uv repair二裂酵母溶胞物5份，山茶花发酵液10份，芽孢杆菌发酵产物0.2份。
[0113]
所述聚丙烯酸钠密度(25℃)为1.32g/ml，购自武汉诺梵生物科技有限公司，型号为al225。
[0114]
所述carbopol uitrez 21购自路博润特种化工(上海)有限公司。
[0115]
所述聚二甲基硅氧烷粘度(25℃)为6pa
·
s,购自道康宁(上海)有限公司，型号为mem-0349。
[0116]
所述nmf-50氨基酸保湿剂购自广州优科生物科技有限公司。
[0117]
所述uv repair二裂酵母溶胞物购自广州优科生物科技有限公司。
[0118]
所述芽孢杆菌发酵产物购自广州优科生物科技有限公司，型号为悦适sirelax。
[0119]
对比例1
[0120]
对比例1的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例1中的山茶花发酵滤液，制备原料包括：盛花期的红山茶花、乳杆菌(lactobacillus)、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、防腐剂和水，重量比为6：5：6：0.7：0.7：0.7：0.1：79。其中乳杆菌为乳杆菌二级种子液。
[0121]
对比例2
[0122]
对比例2的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例2中的山茶花发酵滤液，制备原料包括：落花期的红山茶花、乳杆菌(lactobacillus)、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、防腐剂和水，重量比为6：5：6：0.7：0.7：0.7：0.1：79。其中乳杆菌为乳杆菌二级种子液。
[0123]
对比例3
[0124]
对比例3的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例3中的花蕾期的红山茶花的产地选自云南腾冲。
[0125]
对比例4
[0126]
对比例4的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例4中的乳杆菌的组成按重量份计，包括：植物物乳杆菌(lactobacillus plantarum)1.5份、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)1.5份、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)1.5份、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)3份。
[0127]
对比例5
[0128]
对比例5的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例5中山茶花发酵滤液的发酵工艺，所述步骤(5)的实施方式为，将发酵液进行高温处理，处理温度为80℃，保持30分钟，冷却至25℃后加入防腐剂，得到山茶花发酵滤液。
[0129]
对对比例5得到的山茶花发酵滤液进行常规数据检测，如下表2所示
[0130]
表2
[0131][0132][0133]
对比例6
[0134]
对比例6的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例6中山茶花发酵滤液的发酵工艺，所述步骤(4)的恒温培养温度为25
±
1℃。
[0135]
对比例7
[0136]
对比例7的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例7中山茶花发酵滤液的发酵工艺，所述步骤(4)的恒温培养温度为45
±
1℃。
[0137]
对比例8
[0138]
对比例8的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例8中山茶花发酵滤液的发酵工艺，所述步骤(4)的摇床培养时间为24小时。
[0139]
对比例9
[0140]
对比例9的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例9中山茶花发酵滤液的发酵工艺，所述步骤(4)的摇床培养时间为48小时。
[0141]
对比例10
[0142]
对比例10的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例10中的山茶花发酵滤液，
制备原料包括：花蕾期的红山茶花、乳杆菌(lactobacillus)、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、防腐剂和水，重量比为6：2：6：0.7：0.7：0.7：0.1：82，其中乳杆菌为乳杆菌二级种子液。
[0143]
对比例11
[0144]
对比例11的具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例11中的山茶花发酵滤液，制备原料包括：花蕾期的红山茶花、乳杆菌(lactobacillus)、碳源、维生素、无机盐、低聚果糖、防腐剂和水，重量比为6：12：6：0.7：0.7：0.7：0.1：72，其中乳杆菌为乳杆菌二级种子液。
[0145]
性能测试
[0146]
1、抗氧化性能
[0147]
将实施例1与对比例1-11制得的山茶花发酵滤液用蒸馏水配置成5％的山茶花发酵滤液作为待测样品，体外测试待测样品对羟基自由基清除率(fe-水杨酸法)、超氧阴离子自由基清除率(邻苯三酚法)、fe
3+
还原(fecl3法)脂质过氧化抑制率(硫代巴比妥酸法)、dpph自由基清除率(dpph
·
法)，测试结果如表3所示，实施例1山茶花发酵滤液对dpph
·
以及羟基自由基浓度的影响水平如图2所示。
[0148]
表3
[0149][0150]
2、抗老化性能
[0151]
山茶花发酵液的抗氧化活性通过活性氧(ros)抑制率、胶原蛋白ⅲ生长率和弹性蛋白酶抑制率测定来评估，测试结果如表4所示。
[0152]
(1)ros抑制率
[0153]
将实施例1与对比例1-11制得的山茶花发酵滤液用蒸馏水配置成5wt％和10wt％的山茶花发酵滤液作为待测样品，将待测样品加入培养的正常人真皮层纤维细胞中，培养2h后加入1μg/ml的lps(脂多糖)为刺激剂，测量细胞内ros浓度，实施例1山茶花发酵滤液对培养的正常人真皮成纤维细胞内的活性氧(ros)浓度的影响水平如图3所示。
[0154]
(2)胶原蛋白ⅲ生长率
[0155]
将实施例1-2与对比例1-11制得的山茶花发酵滤液用蒸馏水配置成5wt％的山茶花发酵滤液作为待测样品，将待测样品加入培养的正常人真皮层纤维细胞中，培养2h后，使用高效液相色谱法测定细胞内胶原蛋白ⅲ的含量。使用实施例1山茶花发酵滤液28天前后胶原蛋白iii(密度)的合成模型对比如图4所示。
[0156]
(3)弹性蛋白酶抑制率
[0157]
将实施例1与对比例1-11制得的山茶花发酵滤液用蒸馏水配置成5wt％的山茶花发酵滤液作为待测样品，将待测样品、弹性蛋白酶和结缔组织蛋白质中的弹性蛋白混合均匀后测定590nm处的吸光度值，来计算弹性蛋白酶抑制率，测试结果如表4所示。
[0158]
表4
[0159][0160][0161]
3、将实施例1-2与对比例1-11得到的含山茶花发酵液的山茶花精华乳进行人体抗衰老测试，测试仪器为皮肤弹性测试仪mpa580，测试结果如表5所示。
[0162]
选择30名年龄在40-60岁间，有明显的衰老迹象的志愿者，连续28天，在脸部和前臂使用安慰剂和含5wt％山茶花发酵液的精华，测试皮肤紧密度，细纹改善度，以及肌肤弹性是否得到明显改善。志愿者使用实施例1中5wt％山茶花发酵液的山茶花精华乳28天前后眼部皱纹对比如图5所示，志愿者使用实施例5wt％山茶花发酵液的山茶花精华乳28天前后皮肤紧实度以及细纹改善程度如图6所示，志愿者使用实施例5wt％山茶花发酵液的山茶花精华乳28天前后皮肤净弹性改善程度如图7所示。
[0163]
表5
[0164][0165]