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一种蒲公英繁殖启发的表面增强拉曼散射（SERS）方法

来源：花匠小妙招时间：2025-09-10 20:51

本发明属于单分子检测，尤其涉及一种蒲公英繁殖启发的表面增强拉曼散射(sers)方法。
背景技术：
：：1、表面增强拉曼散射(sers)技术是一种基于拉曼散射效应的高灵敏度分析技术，通过在金属纳米结构表面产生的局域表面等离子体共振(lspr)效应，显著增强目标分子的拉曼信号。sers技术因其高灵敏度、分子特异性和非侵入性，广泛应用于生物医学检测、环境监测、食品安全等领域。特别是在生物医学领域，sers技术被用于检测血液、尿液、唾液等生物液体中的微量分析物，如药物残留、蛋白质、代谢物等。2、尽管sers技术在检测灵敏度方面具有显著优势，但其在实际应用中仍面临诸多挑战：定量检测的复杂性；定性检测的浓度信息不足；静态液体检测的信号弱且重现性差等，不利于实际应用。3、现有的sers技术在定量和定性检测方面存在显著局限性。定量sers检测(文献【bi,x.；czajkowsky,d.m.；shao,z.；ye,j.digital colloid-enhanced ramanspectroscopy by single-molecule counting.nature 2024,628,771-775.】)通常依赖于复杂的仪器设备(如高精度光谱仪)和繁琐的校准程序，导致检测成本高、操作复杂，难以在临床诊断中广泛应用。例如，数字(纳米)胶体增强拉曼光谱(dcers)通过单分子计数实现极低浓度下目标分子的定量检测，但其依赖复杂的仪器和数据处理算法，难以适用于即时检测场景。此外，基于免疫传感器的sers检测方法(如夹层sers纳米结构放大技术)虽然提高了灵敏度，但仍需复杂的样品预处理和校准步骤，限制了其在临床中的应用。定性sers检测(文献【ai,y.-j.；liang,p.；wu,y.-x.；dong,q.-m.；li,j.-b.；bai,y.；xu,b.-j.；yu,z.；ni,d.rapid qualitative and quantitative determination of food colorants byboth raman spectra and surface-enhanced raman scattering(sers).food chemistry2018,241,427-433.】)虽然操作简单(如使用手持拉曼光谱仪进行食品中色素和农药残留的快速检测)，但无法提供足够的浓度信息，难以满足临床诊断中对分析物浓度的快速判断需求。4、在热点构建和分子吸附方面，现有技术也存在诸多不足。热点构建(文献【shang,m.；wei,h.；gao,g.；li,n.；zou,w.；liu,r.；zhang,m.；meng,x.；chen,w.；sun,y.；wang,c.aportable kit for rapid detection of bromadiolone in human blood and urine viasurface-enhanced raman scattering coupled with salt-induced liquid-liquidphase separation.sensors and actuators b:chemical 2023,374.】)通常通过诱导金属纳米颗粒聚集来实现，例如盐诱导液-液相分离(sillps)技术，利用金/银核壳纳米颗粒(au@ag nps)增强sers信号。然而，这种方法可能因无机盐的加入干扰生物样品，且热点密度和分布难以精确控制。分子吸附(文献【guo,y.；zhang,l.；you,h.；fang,j.a solution-based sers sensing protocol via the ultra-rapid and highly efficient moleculeenrichment strategy.sensors and actuators b:chemical 2022,367.】)方面，现有方法如多孔β-环糊精聚合物/磁性纳米颗粒(pcdp-mns)通过分子富集策略提高检测灵敏度，但涉及复杂的吸附和解吸过程，增加了操作难度和工作量。此外，现有的sers活性材料表面吸附位点有限，限制了分子吸附效率，导致信号增强效果不足。5、综上所述，现有的sers技术在定量和定性检测方面存在操作复杂、浓度信息不足等问题，而在热点构建和分子吸附方面则面临热点密度不足、分子吸附效率低等挑战。技术实现思路1、为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种蒲公英繁殖启发的表面增强拉曼散射(sers)方法，通过优化样品预处理步骤和sers活性材料的合成，有效减少了复杂基质对检测的干扰，确保了在人工尿液和模拟尿液样品中的高检测准确度(100％)；同时，通过软件的用户界面，只需输入目标分子、检测到的拉曼光谱和强度因子，即可获得预处理的光谱、特征峰强度和半定量检测结果，极大地简化了操作流程，提高了用户体验。2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：3、一种蒲公英繁殖启发的表面增强拉曼散射(sers)方法，用银纳米颗粒(agnps)吸附待测分子，经过刻蚀、再生长和自聚焦三个连续过程，依次形成金-银合金花(au-agnfs)、金-银合金纳米颗粒的聚集体(agglomerates)和金-银合金团簇(clusters)。4、所述待测分子包括：含巯基和不含巯基的待测分子；其中，含巯基的待测分子包括：4-巯基吡啶(4-mpy)、4-巯基苯甲酸(4-mba)、4-巯基苯胺(4-atp)、1，4-对巯基苯(bdt)、2-巯基苯并噻唑(2-mbt)；不含巯基的待测分子包括：罗丹明6g(r6g)、孔雀石绿(mg)、亚甲基蓝(mb)、结。5、一种蒲公英繁殖启发的表面增强拉曼散射(sers)方法，具体步骤如下：6、步骤1、刻蚀过程：将待测分子与银纳米颗粒(agnps)的溶液充分混合，使待测分子吸附到银纳米颗粒(agnps)上，形成吸附了待测分子的银纳米颗粒(agnps)溶液；吸附了待测分子的银纳米颗粒(agnps)溶液与四氯金酸(haucl4)和盐酸(hcl)的混合溶液充分混合形成混合溶液；混合溶液中，银纳米颗粒(agnps)与四氯金酸(haucl4)发生置换反应，生成银离子(ag+)和金原子(au0)；银离子在混合溶液中自由分散，金原子与未反应的银纳米颗粒(agnps)中的银原子结合形成金-银合金颗粒(au-ag nfs)，待测分子不断吸附在金-银合金颗粒(au-ag nfs)的内部和表面，经过颗粒自组装最终形成金-银合金花；7、步骤2、再生长过程：在步骤1形成的金-银合金花的基础上，继续向步骤1得到的混合溶液中依次加入硝酸银(agno3)和抗坏血酸(aa)充分混合，通过氧化还原反应，待测分子吸附位点数量增加，进而增加了金-银合金颗粒(au-ag nfs)吸附浓度，形成金-银合金纳米颗粒的聚集体；8、步骤3、自聚焦过程：将步骤2得到的金-银合金纳米颗粒的聚集体静置15～30分钟，邻近的金-银合金纳米颗粒的聚集体小颗粒相互聚集，形成具有更多待测分子吸附位点的团簇，发生自聚焦反应，生成大的金-银合金纳米颗粒的聚集体，进而组装形成金-银合金团簇；9、步骤4、通过拉曼光谱仪分别检测步骤1至步骤3反应后的产物的sers光谱。10、所述步骤1中，将预先吸附了待测分子的银纳米颗粒(agnps)溶液加入浓度为0.2～0.3mm四氯金酸(haucl4)和浓度为1～1.5m盐酸(hcl)的混合溶液中进行充分混合，其中，待测分子与银纳米颗粒(agnps)溶液的体积比为1：1～2：1；吸附了待测分子的银纳米颗粒(agnps)混合溶液与浓度为0.2～0.3mm四氯金酸(haucl4)和浓度为1～1.5m盐酸(hcl)的混合溶液的体积比为：1：10～1：20。11、步骤1中所述待测分子采用4-巯基吡啶(4-mpy)溶液，4-巯基吡啶(4-mpy)浓度范围是4.5×10-3～4.5×10-7m，银纳米颗粒(agnps)溶液采用吸收强度为5a.u.～10a.u.的银纳米颗粒(agnps)的胶体溶液。12、所述步骤2中，向步骤1得到的混合溶液中依次加入硝酸银(agno3)和抗坏血酸(aa)；其中，步骤1得到的混合溶液与硝酸银(agno3)的体积比范围为1：100～1：110，硝酸银(agno3)与抗坏血酸(aa)的体积比范围为：1：1～1：3。13、一种基于蒲公英繁殖过程启发的sers方法的浓度指示试剂盒，包括四种试剂之一：14、试剂一：吸收强度为5a.u.～10a.u.的银纳米颗粒(agnps)的胶体溶液；15、试剂二：体积比为800：1～1250：1的四氯金酸(haucl4)和盐酸(hcl)的混合溶液；其中，四氯金酸(haucl4)的浓度为0.2～0.3mm，盐酸(hcl)的浓度为1～1.5m；16、试剂三：浓度为190～210mm的硝酸银(agno3)溶液；17、试剂四：浓度为1.8～2m的抗坏血酸(aa)溶液。18、一种基于蒲公英繁殖过程启发的sers方法的浓度指示试剂盒的使用方法，具体方法为：19、步骤1)将浓度为4.5×10-3～4.5×10-7m的待测分子的样品加到试剂一中，待测分子的样品与试剂一的体积比为1：1～1：2，二者充分混合，使待测分子吸附到银纳米颗粒(agnps)表面，未吸附的待测分子在溶液中自由扩散；20、步骤2)将试剂二加入到步骤1)的混合溶液中，吸附了待测分子的银纳米颗粒(agnps)混合溶液与试剂二中四氯金酸(haucl4)和盐酸(hcl)的混合溶液的体积比为：1：10～1：20；充分混合后静置15～30分钟；21、步骤3)最后，依次向步骤2)得到的混合溶液中加入试剂三和试剂四，充分混合后，使用拉曼光谱仪检测混合溶液的sers光谱；步骤2)得到的混合溶液与试剂三的体积比为1：100～1：110，而试剂三与试剂四的体积比为：1：1～1：3。22、一种基于蒲公英繁殖启发的sers策略的浓度指示试剂盒的半定量检测方法，使用浓度指示试剂盒检测sers光谱，通过用户界面处理并分析数据，最终输出半定量检测结果，具体为：23、步骤1、将浓度为4.5×10-3～4.5×10-7m待测分子样品分别稀释2、5、10倍，其中，待测分子样品分为待测分子标准溶液样品和待测分子模拟尿液样品；待测分子标准溶液样品用超纯水稀释，待测分子模拟尿液样品用尿液稀释；24、步骤2、使用浓度指示试剂盒依次采集稀释前后，待测分子样品的4种浓度样品的sers光谱；25、步骤3、将4条sers光谱按浓度由高至低依次输入计算机的“浓度指示试剂盒”的用户界面，并输入待测分子样品的强度因子if，所述强度因子if为4.5×10-5m待测分子经蒲公英繁殖启发的sers策略的浓度指示试剂盒检测到的1001cm-1特征峰对应的拉曼信号强度；26、步骤4、运行“浓度指示试剂盒”的用户界面，输出待测分子样品的4条sers光谱图形和相对应的特征峰位的强度，以及对待测分子样品的半定量检测判断结果。27、步骤4所述的半定量检测判断结果遵循以下规则：28、①对稀释前到稀释2、5、10倍后的待测分子样品浓度进行依次比较，将浓度逐渐降低，而特征峰强度逐渐增加，判断为稀释前待测分子样品的浓度为高浓度；29、②对稀释前到稀释2、5、10倍后的待测分子样品浓度进行依次比较，将浓度逐渐降低，而特征峰强度先增加后降低，判断为稀释前待测分子样品的浓度为高浓度。30、③对稀释前到稀释2、5、10倍后的待测分子样品浓度进行依次比较，将浓度逐渐降低，特征峰强度也逐渐降低，则比较稀释前待测分子样品的特征峰强与93％强度因子if的大小，若稀释前待测分子样品的特征峰强比待测分子样品的强度因子if的93％小，则稀释前待测分子样品的浓度为低浓度；若稀释前待测分子样品的特征峰强大于等于待测分子样品的强度因子if的93％，判断为稀释前待测分子样品浓度对应的sers信号最强，即指示浓度。31、相对于现有技术，本发明有益效果如下：32、1、在检测性能方面，本发明基于蒲公英繁殖过程启发的sers方法，通过刻蚀过程的热点构建和再生长过程、自聚焦过程分子吸附的协同作用，使分析增强因子达到2.503×105，是传统的银纳米粒子的分析增强因子的4143倍。同时，该方法表现出优异的重现性，10批次间的相对标准偏差仅为6.36％，5位操作者间的相对标准偏差仅为3.30％，在人工和模拟尿液样品中实现了100％的检测准确率。33、2、在操作便利性方面，本发明通过基于蒲公英繁殖过程启发的sers方法的浓度指示试剂盒，仅需依次添加四种试剂进行充分混合，无需复杂的样品预处理过程，从样品添加到获得结果仅需数分钟。使用手持式拉曼光谱仪即可完成检测，操作人员无需专业培训即可使用，极大地简化了检测流程。34、3、本发明在表面增强拉曼散射(sers)活性材料合成过程中加入待测样品，通过模拟蒲公英从种子到花再到果实的繁殖过程，对待测样品的拉曼信号实现了显著增强。使用蒲公英繁殖启发的表面增强拉曼散射(sers)方法检测时，当待测样品为指示浓度(sers信号强度最强的样品溶液的对应分子浓度)时，其sers信号被显著增强；而在除指示浓度以外的其他浓度时，sers信号较弱，成功实现了浓度指示功能。同时解决了传统sers检测方法中热点构建和分子吸附难以兼顾的问题，避免为了构建热点而使用无机盐进而干扰样品检测的问题。35、4、本发明具有广泛的适用性，可检测含巯基和不含巯基的多种目标分子，适用于尿液等复杂生物样品的检测。配合相适应的“浓度指示试剂盒”的用户界面，便于数据分析和结果判读，特别适合临床诊断中的床旁快速检测需求。在成本方面，本发明所需试剂简单，原材料和制造成本低，检测设备便携，无需专业人员操作，具有明显的成本优势。36、综上所述，本发明不仅解决了临床快速半定量检测的需求，提供了可靠的床旁检测解决方案，而且具有显著的产业化和推广应用潜力，为生物医学检测提供了一种实用的新型技术路线。这些优点使得本发明在实际应用中具有突出的竞争优势，特别适合在医疗领域推广应用。当前第1页12当前第1页12