转录因子PsMYB1在调控牡丹花瓣花青苷合成上的应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与牡丹花瓣花青苷合成相关的myb转录因子及其应用。

背景技术：

牡丹(paeoniasuffruticosaandrews)为芍药科(paeoniaceae)、芍药属(paeonia)牡丹组(sect.moutandc.)落叶亚灌木，是原产中国的重要传统观赏植物和药用植物，具有极高的观赏价值和经济价值。花色是观赏植物重要的品质性状。按传统色系来划分，牡丹花色大致可分为红、粉、紫、白、黄、黑、绿、蓝、复色等9大色系。然而，由于长期采用品种群内近缘杂交，我国栽培牡丹品种花色雷同问题日趋严重。阐明牡丹花色形成的分子机制，利用高效的分子生物学手段开展牡丹花色育种势在必行。

研究表明，类黄酮是牡丹花色形成的决定性色素群，不同色系之间，差异主要集中在花青苷的成分和含量上。花青苷合成途径是源自苯丙烷代谢的类黄酮合成途径的一个分支，涉及多个结构基因、调节基因和环境因子的相互作用。其中，含有r2和r3两个dna结合区域(myb基序)的r2r3myb蛋白是植物转录因子中最大的家族之一，也是花青苷生物合成中涉及最广泛的调节因子。目前已知模式植物拟南芥myb家族有124个基因，根据保守元件可划分为22个亚类，调控黄酮类化合物合成的myb蛋白属于stracke分类中的1～7，其中pap1、pap2、myb113和myb114基因可以直接调控花青苷合成酶基因的转录水平，进而促进细胞中花青苷的合成。此外，大量研究表明，myb转录因子的调控作用具有明显的组织特异性；除正调控作用外，还存在对花青苷合成起负调控作用的myb成员；它既可以和bhlh、wdr类转录因子共同作用形成mbw复合体来调控基因的表达，也可以单独进行调控。

目前，对牡丹花色形成相关myb转录因子的研究还处于起步阶段，且大都集中在候选基因的筛选及转基因功能验证等方面，关于其对花青苷合成途径中结构基因的调控作用以及各转录因子间的互作关系还不清楚。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种调控牡丹花瓣花青苷合成相关的myb转录因子的应用。

本发明的技术方案为：转录因子psmyb1或编码转录因子psmyb1的基因在调控牡丹花瓣花青苷合成上的应用，所述转录因子psmyb1的氨基酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，所述应用为转录因子psmyb1或编码转录因子psmyb1的基因在激活牡丹psdfr基因或/和psans基因启动子上的应用。

进一步地，上述所述编码转录因子psmyb1的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明选取中原牡丹品种‘玉板白’(白色花)、‘赵粉’(粉色花)和‘黑花魁’(深紫红色花)为试材，基于转录组数据和生物信息学分析，筛选出2个可能参与牡丹花青苷合成调控的myb转录因子psmyb1和psmyb2，采用race-pcr和rt-pcr相结合的方法，分离了psmyb1和psmyb2的cdna全长，并开展了基因表达模式分析，发现psmyb1可能在调控花青苷合成中起关键作用。通过酵母单杂技术、双荧光素酶试验和活体成像试验，证明psmyb1能够结合到psdfr和psans的启动子区域，激活它们的表达，也能参与组成mbw复合体，增强psdfr和psans的启动子活性，促进花青苷的合成。本发明为揭示牡丹花色形成的转录调控机制提供思路和依据，并为观赏植物花色分子育种提供了重要靶基因。利用psmyb1能够促进花青苷合成途径下游结构基因表达的作用，以其为外源基因，可通过转基因技术培育花色变异的花卉新品种。

附图说明

图1为牡丹myb基因家族进化树分析；

图2为psmyb1、psmyb2、psmyb3转录因子在不同色系牡丹花朵着色进程中的表达模式；

图3为psmyb1、psmyb2、psmyb3转录因子多重序列比对分析；

图4为酵母双杂交(y2h)体系分析转录因子间的互作；

图5为双分子荧光互补(bifc)验证psmyb1、psbhlh1和pswd40-1的相互作用；

图6为重组酵母在选择性培养基sd/leu/abar上的筛选；

图7为双荧光素酶试验分析转录因子对启动子的调控作用；

图8为荧光素酶互补成像分析转录因子对启动子的调控作用。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

1.材料与方法

1.1试验材料

本研究以牡丹白色花品种‘玉板白’(p.suffruticosa‘yubanbai’)、粉色花品种‘赵粉’(p.suffruticosa‘zhaofen’)和深紫红色花品种‘黑花魁”(p.suffruticosa‘heihuakui’)为试材，采自中国林业科学研究院玉泉山牡丹种植基地。参照牡丹生长发育年周期的划分，并结合对牡丹花蕾发育和花朵着色过程的观察，将其花朵开放进程划分为4个阶段：1级，硬蕾期(stage1：未着色紧实花蕾)；2级，透色期(stage2：轻微着色，花朵即将开放)；3级，初开期(stage3：花朵初开)；4级，盛开期(stage4：花朵盛开，花药外露)。分别采集三个品种不同发育时期的花瓣，液氮速冻后于-80℃冰箱中保存备用。所用的本氏烟草(nicotianabenthamiana)种子由本实验室保存，种子播种在基质中，在光照培养箱中培养，光周期为14h/10h昼/夜，待植株长至4～6片真叶用于下一步实验。

1.2载体、试剂和菌株

载体：克隆载体pmd19-t、酵母双杂载体pgadt-7和pgbkt-7购自takara公司；双分子荧光互补载体puc-spyne和puc-spyce购自淼灵质粒平台；酵母单杂载体pabai、双荧光素酶载体pgreenii0800-luc和pgreenii62-sk为本实验室保存。

试剂盒：rna提取试剂盒(rn33-plantpure通用植物总rna快速提取试剂盒)购自北京艾德莱生物科技有限公司；反转录试剂盒(one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix)购自北京全式金公司；race试剂盒(smarterrace5’/3’kit)、荧光定量试剂盒(tbgreentmpremixextaqtm)、质粒提取试剂盒(minibestplasmidpurificationkitver.4.0)和胶回收试剂盒(minibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0)均购自takara公司；基因组dna提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

菌株：大肠杆菌菌株dh5α和农杆菌菌株gv3101、酵母菌株y2h和y1h均购自上海唯地生物技术有限公司。

试剂与药品：ypda培养基、二缺sd/-trp-leu培养基、四缺sd/-ade/-his/-leu/-trp培养基、sd/-leu培养基和sd/-ura培养基等均购自北京酷来搏科技有限公司。配制步骤如下：

1)ypda培养基(1l)：

将20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物加入去离子水，定容至935ml，ph调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入50ml40％葡萄糖和15ml0.2％腺嘌呤。

2)缺陷型酵母培养基(1l)：

在900ml去离子水中加入8g的sd+缺陷型氨基酸混合物，搅拌溶解。调节ph至5.8，121℃高压灭菌15分钟。4℃冰箱避光储存已经灭菌的液体培养基，使用前加入100ml已过滤除菌的20％葡萄糖溶液，或者其它碳源。

3)lb培养基(1l)

将下列组分溶解在900ml水中：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5gnacl；用1ml1mol/lnaoh调节ph至7.0，再用去离子水定容至1l，高压下蒸汽灭菌20min；若配制固体培养基则需添加琼脂12g/l。

4)其他试剂：

①1×peg/liac:8ml50％peg3350，1ml10×te，1ml1mol/lliac。

②x-α-gal：溶解60mgx-α-gal于3mldmf(n,n-二甲基甲酰胺)，终浓度为20mg/ml。

③金担子素a(aba)：用甲醇溶解，使其终浓度为1mg/ml。

④氨苄青霉素(100mg/ml)：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25μg/ml～50μg/ml的终浓度添加于生长培养基。

⑤卡那霉素(10mg/ml)：溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10μg/ml～50μg/ml的终浓度添加于生长培养基。

1.3牡丹myb基因家族成员的筛选和分析

1.3.1牡丹myb基因家族成员的筛选

利用pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)网站下载到的myb结构域pf00249序列为查询序列(query)，通过本地blast对前期获得的‘黑花魁’花瓣转录组数据库进行tblastn搜索。将得到的unigene序列在pfam和cdd(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)在线数据库中进行结构域分析和校验，去除结构域完整度低于30％的序列。

1.3.2系统发育分析

自tair网站(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)下载拟南芥myb基因家族序列。利用软件muscle(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/muscle/)，以默认参数对拟南芥和推测的牡丹myb家族成员的蛋白序列进行多序列比对，利用mega7.0的邻接法(neighbor-joining，nj)构建系统发育树。

1.4总rna提取

按照rn33-plantpure通用植物总rna快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)说明书，进行rna提取。具体方法如下：

1)取500μl裂解液rlt，转入1.5ml离心管中，加入50μlplantaid混匀备用。

2)液氮中研磨适量牡丹花瓣成细粉后，取50mg细粉转入上述装有rlt和plantaid的离心管，立即用涡旋仪剧烈振荡20秒，充分裂解。

3)将裂解物13,000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的plantaid。

4)取裂解物上清转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5)立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱ra中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心2分钟，弃掉废液。

6)加700μl去蛋白液，室温放置1分钟，13,000rpm离心30秒后弃废液。

7)加入500μl漂洗液rw，13,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液rw，重复一遍。

8)将吸附柱ra放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9)取出吸附柱ra，放入一个rnasefree离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加30-50μlrnasefreewater(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。

10)如果预期rna产量>30μg，加30-50μlrnasefreewater重复步骤9，合并两次洗液。

1.5反转录

cdna第一链的合成按照one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix(北京全式金生物)说明书进行。具体步骤如下：

按照表1的基因组dna的去除体系配制反应混合液，轻轻混匀。置于42℃恒温水浴锅中孵育30min，若用于荧光定量反应，则孵育15min即可。85℃加热5s失活rt与gdnaremover。

表1gdna去除和反转录反应体系

1.6荧光定量pcr

利用ncbi的primer-blast在线软件，根据筛选到的unigene序列设计特异性引物。参照荧光定量试剂盒tbgreentmpremixextaqtm(takara)说明书，以pspp2a为内参基因，采用2-δδct法，在rochelight480实时荧光定量pcr仪上进行候选基因相对表达量分析。每次定量试验均设置3个生物学重复和3个技术重复。引物序列见表2。

表2荧光定量pcr所用引物

1.7基因克隆及序列分析

以‘黑花魁’牡丹盛开期花瓣提取的总rna反转录合成的cdna第一链为模板，根据unigene序列分别设计psmyb1和psmyb2的5’race和3’race特异性引物。按照smarterrace5’/3’kit(takara)说明书进行5’和3’端序列扩增。pcr扩增产物由1.2％琼脂糖凝胶电泳检测回收。将与预期片段大小一致的条带连接到pmd19-t载体上，再转化到大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白筛选及菌液pcr鉴定后，进行测序分析。

利用ncbi上cd-search和orf工具对基因开放阅读框和编码蛋白的保守结构域进行预测；利用expasy服务器中的prot-param工具在线预测目的基因编码蛋白的基本理化性质；基因序列同源性比对用dnaman软件完成；运用mega7.0软件进行系统进化树的构建。相关引物序列见表3。

表3race-pcr所用引物

1.8酵母双杂交

1.8.1bait载体和prey载体构建

按照matchmakertmgoldyeasttwo-hybrid(clontech)说明书，将psmyb1和psmyb2以及筛选出来的可能参与牡丹花瓣花青苷生物合成调控的bhlh和wd40转录因子的开放阅读框分别搭载到含gal4结合dna结构域(bd，bindingdomain)的pgbkt7载体和含gal4激活结构域(ad，activationdomain)的pgadt7载体上。所用引物见表4。

表4酵母双杂所用引物

1.8.2bait质粒和prey质粒的共转化

利用peg/liac法将分别搭载psmyb、psbhlh和pswd40的质粒进行两两组合后，转化到y2hgold酵母菌株中，依次涂布到缺亮氨酸和色氨酸的sd培养基(sd/-leu/-trp)，接着在缺腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸和色氨酸的sd培养基(sd/-ade/-his/-leu/-trp)上进行筛选。最后利用x-α-gal验证β-galactosidase活性的方法分析所得到的阳性互作。转化步骤如下：

1)取100μl冰上融化的y2hgold感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒、阳性对照(pgbkt7-53+pgadt7-t)和阴性对照(pgbkt7+pgbkt7-lam)2-5μg，carrierdna(95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μl，peg/liac500μl，并吸打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。

2)将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。

3)5000rpm离心40s弃上清，ddh2o400μl重悬，离心30s弃上清。

4)ddh2o50μl重悬，涂板，29℃培养48-96h。

1.9双分子荧光互补

通过无缝克隆的方式将去掉终止密码子的psmyb1、psbhlh1和pswd40-1的orf序列构建到puc-spyne(puc-spyce)的bamhi和xhoi酶切位点之间。所用引物见表5。

表5双分子荧光互补试验所用引物

1.10农杆菌介导瞬时转化本氏烟草叶片及荧光观察

分别将pspyne/psbhlh1、pspyce/psmyb1、pspyne/pswd40-1、pspyce/pswd40-1、空载体质粒pspyne、空载体质粒pspyce、阳性对照质粒pspyne/bzip63、阳性对照质粒pspyce/bzip63和核marker质粒ghd7-cfp通过热激法转入农杆菌gv3101。2-3天后经菌落pcr鉴定获得阳性克隆，挑取单菌落接种于lb液体培养基中(kan100mg/ml、rif100mg/ml)，28℃摇床中200rpm振荡过夜培养。取100μl新鲜菌液接种于50mllb液体培养基中扩大培养至菌株生长对数期，然后常温5000×g离心5min。去除上清，尽量不要残留多余的lb培养基，用配制好的侵染缓冲液(10mmmes,10mmmgcl2,200mmas,ph5.6)重悬菌体，将菌液浓度调整至od600＝0.75。按照不同组合将菌液1:1等量混匀。黑暗中静置2-3h，用无针头的1ml注射器注射4～6叶期的本氏烟草叶片背面，注射后的烟草注意保湿，过夜暗培养后，置于光照培养箱中培养2-3天后观察。3d后，将叶片剪成5mm左右小方块，置于载玻片上，采用激光共聚焦显微镜(zeisslsm510meta,jena,germany)观察yfp荧光的表达情况。yfp荧光激发波长514nm，接收波段500～560nm。叶绿体自发荧光激发波长为633nm，接收波长范围为650～720nm。所有瞬时表达实验重复三次。

1.11酵母单杂交

1.11.1载体构建

将牡丹花青苷生物合成8个关键结构基因(pschs、pschi、psf3h、psf3’h、psfls、psfns、psdfr和psans)的启动子序列连接到pabai载体，构建酵母单杂交诱饵载体(bait)；将牡丹myb、bhlh和wd40三个转录因子的cds序列连接到pgadt-7载体，构建酵母单杂猎物载体(prey)。通过bioedit软件查找，选取bstbi/bbsi对pabai重组质粒进行单酶切。线性化处理后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收。

1.11.2bait菌株转化及菌株鉴定

将线性化后的pabai-chs、pabai-chi、pabai-f3h、pabai-f3’h等片段转入y1h感受态细胞，涂于sd/-ura固体培养基，30℃恒温箱中倒置培养3-5d。转化具体操作步骤如下：

1)取100μl冰上融化的y1hgold感受态细胞，依次加入预冷的线性pbait-abai目的质粒1-5μg(体积不高于15μl)，carrierdna(95-100℃5min，快速冰浴，重复一次)10μl，peg/liac500μl并吸打几次混匀，30度水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。

2)将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。

3)5000rpm离心40s弃上清，ddh2o400μl重悬，离心30s弃上清。

4)ddh2o50μl重悬，涂sd/-ura平板，29℃培养72h。

5)挑取5-10个单克隆，利用matchmakerinsertcheckpcrmix1进行菌落pcr验证，确定pbait-abai整合到y1hgold基因组中。同时，使用未转化的y1hgold单克隆作为阴性对照。预期菌落pcr分析结果为阳性诱饵菌株1.35kb+插入片段大小，而阴性对照没有带。

6)pcr阳性菌株在sd/-ura平板划线，29℃培养72h，4℃保存，此菌株即是y1hgold[bait/abai]菌株。

1.11.3重组酵母株y1h(pabai-bait)aba背景浓度的筛选

为排除实验过程中的假阳性，需筛选出最适宜的aba浓度，具体如下：

1)将上述测序正确的菌株，挑取一个2-3mm的阳性单克隆，溶于0.9％nacl(w/v)，在紫外分光光度计下将其od600调至0.002左右；

2)提前配置好浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、500ng/ml、550ng/ml、600ng/ml、650ng/ml、700ng/ml、750ng/ml、800ng/ml、850ng/ml、900ng/ml、950ng/ml)的sd/-ura/aba缺素培养基，吸取100μl菌液依次涂布不同浓度的培养基上，同时用p53-abai做阳性对照，置于30℃恒温培养箱倒置培养2-3d；

3)相关研究表明，抑制酵母菌生长的适宜的aba浓度一般为100-200ng/ml，若不能有效抑制，则提高其浓度至500-1000ng/ml。如果在aba浓度为1000的缺素培养基上仍能正常生长，说明该基因不适应用aba系统进行检测。

1.11.4基因与蛋白相互作用检测

1)把菌株y1h(pabai-chs、pabai-chi、pabai-f3h、pabai-f3’h、pabai-fls、pabai-fns、pabai-dfr、pabai-ans和阳性对照p53-abai)在sd/ura平板上划线复苏，2-3d后长出单菌落，挑取大约3mm的单菌落制备感受态细胞；

2)将重组质粒pgadt7-myb1、pgadt7-bhlh1和pgadt7-wd40-1转入酵母感受态细胞y1h(pabai-chs、pabai-chi、pabai-f3h、pabai-f3’h等)中，阳性对照质粒pgadt7-53也转入对应的y1h(p53-abai)感受态中，将以上转化好的感受态涂于sd/-leu(sd培养基缺亮氨酸)和sd/-leu/aba(已筛选的aba浓度)两种培养基上，于30℃恒温培养箱中培养3-5d；

3)此外，还设置了阴性对照，即将pgadt7空质粒依次转入酵母感受态y1h(pabai-chs、pabai-chi、pabai-f3h、pabai-f3’h等)中，同样涂布于sd/-leu(sd培养基缺亮氨酸)和sd/-leu/aba(已筛选的aba浓度)两种培养基上，于30℃恒温培养箱中培养3-5d；

4)观察所有组合在sd/-leu和sd/-leu/aba*培养基上的生长情况，若在两种培养基上均能长出正常的酵母细胞，表明目的蛋白和启动子之间有相互作用。

1.12双荧光素酶试验

1.12.1表达载体构建

通过无缝克隆的方式分别将psmyb1、psbhlh1和pswd40-1序列构建到pgreenii62-sk的两个酶切位点(bamhi和kpni)之间，获得35s启动子驱动的植物过量表达载体35s:psmyb1、35s:psbhlh1和35s:pswd40-1。将牡丹花青苷生物合成8个关键结构基因pschs、pschi、psf3h、psf3’h、psfls、psfns、psdfr和psans的启动子序列分别构建到pgreenii0800-luc的两个酶切位点(sali和bamhi)之间，获得表达载体。

1.12.2瞬时转化烟草和荧光素酶活性测定

1)侵染菌液的制备。

将上述构建好的载体、空载体pgreenⅱ62-sk和空载体pgreenⅱ0800-luc通过热激法转入农杆菌gv3101。2-3天后经菌落pcr鉴定获得阳性克隆，挑取单菌落接种于lb液体培养基中(kan100mg/ml、rif100mg/ml)，28℃摇床中200rpm振荡过夜培养。取100μl新鲜菌液接种于50mllb液体培养基中扩大培养至菌株生长对数期，然后常温5000×g离心5min。去除上清，尽量不要残留多余的lb培养基，用配制好的侵染缓冲液(10mmmes,10mmmgcl2,200mmas,ph5.6)重悬菌体，将菌液浓度调整至od600＝0.75。将含有启动子和转录因子的不同类型的组合按照1:1等量混匀。黑暗中静置2-3h，用无针头的1ml注射器注射4～6叶期的本氏烟草叶片背面，注射后的烟草注意保湿，过夜暗培养后，置于光照培养箱中培养2-3天后，采样测定叶片的luc和ren活性。

2)荧光素酶活性的测定。

①用打孔器取直径3mm的叶片(烟草瞬转后48-72h)，在预冷的小研钵中加入380μl的1×plb缓冲液，充分研磨。吸取2.5μl研磨液至新的100μl1×plb缓冲液中，混匀稀释，冰上放置备用。

②检测仪器为modulusluminometer(promega，美国)，打开仪器，选择protocol，选择runpromegaprotocol，选择dlr-o-inl，在暗室里进行操作。

③在新的离心管中加入样品液5μl，吸取45μl的larii轻轻吸打2-3次(切勿剧烈)，用小离心转子稍微离心，放入仪器，点击测定，此时下方读条大约10s。

④读条结束后，不要触碰屏幕，将测定的离心管取出，加入50μl的stop*glosubstrate(稀释50倍)快速吸打10-15次，小离心转子稍微离心。放入仪器，点击测定，此时第二次读条。

⑤待读条结束，屏幕显示测定结果rl1、rl2和ratio，一个样品测定完成后，继续步骤6和7，同种菌株至少测定3个叶片。测定完成记录数据。

1.12.3荧光观察

提前打开活体成像系统newton7.0bioplantimagingsystem(vilberlourmat,france)，预冷30分钟；将侵染后的烟草叶片取下，用配制的荧光素酶喷液均匀喷湿背面；室温下黑暗放置5-10min；将烟草放至成像系统中，进行荧光成像并拍照。

2.结果

2.1牡丹myb转录因子的筛选和表达模式分析

通过本地tblastn检索及保守结构域鉴定分析，共筛选到123个非冗余牡丹myb基因家族成员。根据不完全重复区域数目(r)可分为4个类型，包括60个r2r3myb，57个myb-relate，4个r1r2r3-myb和2个4r-myb。依据拟南芥r2r3-myb蛋白家族的划分，将牡丹60个r2r3-myb蛋白与之构建系统进化树，设定bootstrap值为1000。如图1所示，筛选到psmyb1、psmyb2和psmyb3与atmyb113、atmyb114等在花青苷合成中起重要作用的成员聚类到第6亚家族，推测它们在牡丹中具有相似的功能。

对psmyb1、psmyb2和psmyb3转录因子在牡丹不同花色形成过程中的表达模式进行荧光定量分析，如图2所示，psmyb1的表达与花青苷的合成密切相关，在无花青苷的‘玉板白’花瓣中几乎没有表达，在有花青苷积累的‘赵粉’和‘黑花魁’花瓣中大量表达，且‘黑花魁’中的表达量远高于‘赵粉’，并伴随着花瓣的着色进程自硬蕾期开始迅速上升，至初开期达到最高值后快速下降；与其相反，psmyb2在‘玉板白’中的表达量最高，在‘赵粉’和‘黑花魁’中的表达量极低；而psmyb3在3个品种花瓣中的表达量均很低，且没有明显的变化规律。

2.2psmyb1和psmyb2的克隆和序列分析

以深紫红色花品种‘黑花魁’盛开期的花瓣总rna反转录而来的cdna为模板，采用race-pcr和rt-pcr相结合的方法，对psmyb1和psmyb2进行cdna全长克隆。结果表明(图3)，psmyb1和psmyb2的orf全长分别为648bp和561bp，分别编码215个和186个氨基酸。它们与已知调控花青苷生物合成的矮牵牛phan2、非洲菊ghmyb10、苹果mdmyb、葡萄vlmyba1和杨梅mrmyb1的序列相似性在40％-50％之间。同时，psmyb1和psmyb2的n端氨基酸序列上均含有保守的r2和r3区域，在r3结构域中包含一个能与bhlh转录因子相互作用的[de]lx2[rk]x3lx6lx3r基序，说明这两个蛋白可能和某个花色相关bhlh转录因子相互作用；在c端氨基酸序列上含有与花青苷生物合成相关的保守结构域([k/r]p[q/r]p[q/r])，进一步说明psmyb1和psmyb2可能参与调控了牡丹花瓣花青苷的合成。

2.3psmyb1、psmyb2与bhlh、wd40转录因子的互作分析

酵母双杂交结果表明(图4)，只有组合ad-psbhlh1+bd-psmyb1和组合ad-psbhlh1+bd-pswd40-1转化的酵母细胞可以在含有x-α-gal和aba的四缺培养基上(sd-ade-his-leu-trp)正常生长并呈现蓝色。为进一步验证该结果，在本氏烟草中进行了双分子荧光互补试验(bifc)。如图5所示，仅将含有组合psbhlh1-nyfp+psmyb1-cyfp和组合psbhlh1-nyfp+pswd40-1-cyfp的农杆菌注射到烟草叶片内后，可观察到细胞核中的yfp荧光信号，且同阳性对照(bzip63-nyfp+bzip63-cyfp)相比，yfp荧光信号更强。以上结果证明，psmyb1可与psbhlh1、pswd40-1形成mbw复合体，互作模式为psmyb1和pswd40-1分别与psbhlh1互作，但psmyb1不能与pswd40-1互作。

2.4转录因子激活作用检测

酵母单杂交结果显示(图6)，除阳性对照外，组合y1h[pgadt7-psmyb1+pabai-dfr]、y1h[pgadt7-psmyb1+pabai-ans]、y1h[pgadt7-psbhlh1+pabai-dfr]和y1h[pgadt7-psbhlh1+pabai-ans]能在平板上长出单菌落，表明psmyb1蛋白作为转录因子能与花青苷合成途径中下游结构基因psdfr和psans启动子相互识别，发生蛋白质-dna相互作用，从而激活下游报告基因abar的表达。

双荧光素酶试验结果表明(图7)，与注射空载体pgreenⅱ62-sk相比，单独注射35s:psmyb1可直接激活psdfr和psans启动子片段的活性。而35s:psmyb1与35s:psbhlh1共同注射的叶片中psdfr启动子活性分别提高了2.8倍、3.2倍，psans启动子活性分别提高了4.6倍、6.3倍；35s:psmyb1、35s:psbhlh1和35s:pswd40-1共同注射的叶片中，psdfr和psans两个启动子活性均达到了最大值，psdfr启动子活性分别提高了4倍、4.8倍，psans启动子活性分别提高了4.9倍、6.7倍。

活体成像试验也证实了该结论，如图8中a所示，当分别注射psmyb1+psdfr/psans、psbhlh1+psdfr/psans、psmyb1+psbhlh1+psdfr/psans和psmyb1+psbhlh1+pswd40-1+psdfr/psans时，均可以观察到明显的红色信号，证明转录因子和启动子有很好的结合作用，且注射psmyb1+psbhlh1+pswd40-1+psdfr/psans组合时，红色信号明显增强。

综合以上结果证实，psmyb1能够单独激活psdfr和psans启动子的表达，也能和psbhlh1、pswd40-1组成复合体提高psdfr和psans的启动子活性，从而促进牡丹花瓣内花青苷的合成。

序列表

<110>中国林业科学研究院林业研究所

<120>转录因子psmyb1在调控牡丹花瓣花青苷合成上的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>215

<212>prt

<213>牡丹(paeoniasuffruticosa)

<400>1

metgluglyargileleuglyleuarglysglyalatrpthrhisglu

151015

gluaspcysleuleuargasncysvalglulystyrglyglnglugln

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<213>牡丹(paeoniasuffruticosa)

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