红瓤核桃 JrbHLHA2 转录因子靶向查尔酮合成酶基因 JrCHS4 调控种皮花青苷合成的功能研究

摘要：【目的】查尔酮合成酶（CHS）是植物花青苷合成途径中的第一个限速酶，探究红瓤核桃（JuglansregiaL.RW-1）查尔酮合成酶（CHS）在种皮花青苷合成中的功能，为红瓤核桃的品种改良提供理论支撑。【方法】以红瓤核桃RW-1和普通核桃中林1号不同发育期的种皮为材料，根据qRT-PCR结果，筛选并克隆JrCHS4基因；克隆2种核桃JrCHS4的启动子序列，通过GUS染色和GUS蛋白定量分析启动子活性差异；通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶检测试验（LUC）验证上游bHLH转录因子对JrCHS4启动子的调控作用；通过农杆菌介导将JrCHS4瞬时转化烟草叶片，观察叶片颜色及花青苷含量的变化。【结果】花后60、120d时仅JrCHS4在红瓤核桃种皮中的表达量显著高于普通核桃种皮且表达量差异最大，分别约为66.04、11970.93倍，花后90d时除JrCHS4在2种核桃种皮中的表达量基本相同外，其他3个JrCHSs在红瓤核桃种皮中的表达量均显著低于普通核桃种皮，推测JrCHS4可能是红瓤核桃种皮花青苷合成的关键基因。GW-JrCHS4启动子与RW-JrCHS4启动子具有98.50%的同源性，含有许多响应激素如脱落酸、乙烯、赤霉素以及与逆境胁迫相关的顺式作用元件，与GW-JrCHS4启动子相比，RW-JrCHS4启动子缺失了1个MYB结合位点MYB1AT，插入了1个bHLH结合位点MYCCONSENSUSAT。GUS染色结果表明，RW-JrCHS4启动子诱导产生的蓝色深于GW-JrCHS4启动子诱导产生的蓝色；经GUS蛋白定量检测，RW-JrCHS4启动子活性显著高于GW-JrCHS4启动子活性，约是GW-JrCHS4启动子活性的1.17倍。酵母单杂交试验结果表明，JrbHLHA2可以特异性结合JrCHS4启动子；经LUC试验进一步验证，JrbHLHA2能够显著激活JrCHS4启动子的活性，其LUC/REN比值约是对照的2.45倍。瞬时转化JrCHS4的烟草叶片绿色变浅呈现轻微的红色，总花青苷含量得到了显著提高，约是对照的1.09倍，表明JrCHS4能够促进花青苷的生物合成与积累。【结论】红瓤核桃JrbHLHA2转录因子靶向查尔酮合成酶基因JrCHS4是调控红瓤核桃种皮花青苷合成的关键因素。

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