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甘蔗花粉低温储存方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-06-24 21:40

本发明涉及一种甘蔗花粉低温储存的方法。

背景技术：

花粉是植物完成有性杂交必不可缺的，其含有物种的所有基因类型，具有丰富的遗传多样性，是种质储存和交换的重要材料之一，但是在自然条件下，绝大多数植物花粉的寿命都非常短，这给杂交育种工作带来极大不便，同时也不利于相关的植物遗传学研究。

1922年knowlton首先报道了-180℃储存后的金鱼草花粉仍具有生活力，同时发现降低花粉含水量能够提高金鱼草花粉冰冻储存的生存率。1938年，brandes和sartoris以特制容器盛装一耐寒割手密品系的花粉由美国首都空运往南美与poj2725杂交，并获得杂交实生苗，首次实现了甘蔗花粉的短期储存。但在其后的十多年里，甘蔗花粉储存技术并无多大进展。直到1961年，king创造了可使储存时间大大延长的花粉冻干处理，随后coleman和buzacott分别以冻干处理过的甘蔗储存花粉进行杂交出苗试验，均获得了少量实生苗。但由于冻干处理的实用性和确切效果等方面的问题，使甘蔗花粉储存研究工作又一度沉寂了下来。80年代后植物花粉超低温储存研究日渐兴起。1979年akihama等在日本果树实验站建立了花粉库（pollenbank），美国在80年代也相继建立了三个花粉超低温中心（stanwood，etal，1986；anonymous1987；parfitta1988）进行花粉超低温储存并对储存机理进行了探讨（ganeshans.etal,1990）。1983年，tai以多个割手密品系的花粉材料作储存研究，配以花粉离体萌发进行活力检测，经过连续几年的试验，证明野生蔗割手密的花粉在超低温-80℃条件下储存，其活力至少可以储存30天。这一技术引起我国甘蔗育种界的重视，并在2005年由云南农大的李富生老师利用蔗茅材料得以证实。

但是在杂交育种上利用最多，具有各种高糖、高抗性的甘蔗品系材料，由于其花粉活细胞壁较薄，对外界气候变化敏感，其甘蔗花粉在散粉1h后即丧失活力，至今国内仍未有相关具体储存技术及应用的报道。随着气候条件和种植环境的变化，甘蔗种质资源亲本材料开花困难、亲本花期不遇的现象越发严重，而利用光周期诱导、调节甘蔗种植期、喷洒植物激素等方法调节亲本花期费时费力且效果不明显，使得甘蔗杂交育种亲本组配材料选择受限，导致新品种选育缓慢，因此研究开发一种甘蔗花粉低温储存技术十分必要。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种甘蔗花粉低温储存方法，其可解决甘蔗杂交育种中亲本花期不遇或远距离杂交时提供有活力的父本花粉材料的问题，具有储存甘蔗花粉灵活，技术可靠，成本低，操作安全，效果好等优点。

本发明目的可通过如下技术方案实现：

方案一，甘蔗花粉低温储存的方法，包括如下步骤：

1）甘蔗花粉供体亲本处理：选取发育正常、无病虫危害的健壮甘蔗植株，在花穗盛开期，提前一天将甘蔗亲本从茎中下部一次性砍断，带回杂交温室并养于亚硫酸溶液中。

2）花粉采集：翌日早晨7:30开始观察螽花开放时间，及时收集花粉倒入40目～50目不锈钢筛，过筛后装入离心管备用。

3）花粉储存：将步骤2的新鲜花粉和变色硅胶颗粒按质量比1：7～1：8充分混合后装入2ml冻存管中，在4℃冷藏室下静置8～12min，使花粉含水量降到30%～25%；用镊子夹出硅胶颗粒后放在0℃冰箱中储存1～5天。

优化方案：还包括步骤：

4）当花粉需要萌发鉴定时，将储存的花粉直接置于液体培养基中，28℃~32℃下萌发。

方案二，甘蔗花粉低温储存的方法，包括如下步骤：

1）甘蔗花粉供体亲本处理：同方案一。

2）花粉采集：同方案一。

3）花粉储存：将步骤2的新鲜花粉和变色硅胶颗粒按质量比1：4～1：5充分混合后装入2ml冻存管中，在4℃冷藏室下静置15～18min，使花粉含水量降到20%～15%；用镊子夹出硅胶颗粒后将其密封放在-20℃冰箱中储存5～30天。

优化方案：还包括步骤：

4）当花粉需要萌发鉴定时，将储存的花粉平铺到湿盒中，4℃下复水30min后再置于液体培养基中，28℃～32℃下萌发。

本发明具有如下突出的实质性特点和显著的进步：

（1）本发明克服了甘蔗花粉一直难以储存的困难，首次建立了甘蔗花粉低温储存技术，包括花粉采集、干燥、储存、复水等，可延长花粉30d内活力不失。

（2）本发明为甘蔗杂交育种研究，新组合的创制提供了可能，对甘蔗新品种的选育具有重要应用价值。如晚花品种（系）授早花品种（系）的花粉实现自然杂交不可能出现的组合；可以进行甘蔗和蔗茅、河八王、斑茅等的远缘杂交；花期不遇的甘蔗亲本间杂交；本发明的应用可以极大丰富甘蔗杂交育种的组合范围，打破甘蔗花穗杂交的时空限制，丰富甘蔗资源的遗传多样性。

（3）本发明所述的甘蔗花粉低温储存方法简单易操作，成本低，能有效保证甘蔗花粉进行杂交的生活力，在甘蔗杂交育种上具有重要的实践与推广意义。

附图说明

图1，低温储存花粉在甘蔗柱头萌发情况图。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例一，甘蔗花粉低温储存方法，包括如下步骤：

步骤一，甘蔗花粉供体亲本处理：将待采集花粉的甘蔗母本于前一天下午带茎砍回并放入亚硫酸养茎液中，保证蔗茎提供充足养分以供花穗开花所需营养。

步骤二，花粉采集：翌日早晨7:30开始观察螽花开放时间，及时收集花粉，利用40目~50目不锈钢筛去掉花药等杂质，取纯净花粉迅速装入干燥的离心管中密封避光储存。

步骤三，花粉储存：称取步骤二的新鲜花粉，将新鲜花粉和变色硅胶按质量比1:7~1:8充分混合后装入2ml冻存管中，在4℃冷藏室下静置8～12min，使花粉含水量降至30%~25%。之后用镊子夹出硅胶颗粒后分别密封放在常温、4℃、0℃和-20℃环境下储存，间隔一定时间内，通过花粉离体萌发测定其萌发率。

结果如表1所示：常温下储存1d已经全部失活；-20℃环境下花粉也很快失去活力，可知30%~25%花粉含水量在0℃以下容易结冰致使甘蔗花粉冰冻死亡；4℃下储存2d活力仍有36.2%，之后迅速降低，储存5d后失活；0℃下储存5d后花粉活力仍高达51.3%。考虑到甘蔗花粉对外界环境较为敏感的特性，从人工授粉实际应用角度出发，储存5d后萌发率达到51.3%的花粉仍有很强的杂交授粉优势，可见在5d内授粉，选择含水量30%~25%的花粉在0℃下储存途径较为合适。

表1不同储存温度下甘蔗花粉离体萌发率

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实施例二，甘蔗花粉低温储存方法，包括如下步骤：

步骤一，甘蔗花粉供体亲本处理，同实施例一。

步骤二，花粉采集，同实施例一。

步骤三，花粉储存，称取步骤二的新鲜花粉，将新鲜花粉和变色硅胶颗粒按质量比1:4～1:5充分混合后装入2ml冻存管中，在4℃冷藏室下静置15～18min，使花粉含水量降至20%～15%。之后用镊子夹出硅胶颗粒后分别密封放在常温、4℃、0℃和-20℃环境下储存，间隔一定时间内，通过花粉离体萌发测定其萌发率。

结果如表2所示：从表2可以看出，花粉含水量降低到20%～15%时，常温下1d内已经全部失活；4℃下储存1d后花粉活力高达70.3%，但是10d后已经全部失活；0℃下储存10d后仍有18.3%的萌发率，20d后通过花粉离体萌发已无萌发现象。

-20℃储存的花粉，将储存的花粉平铺到湿盒中，4℃下复水30min后再置于液体培养基中，28℃～32℃下萌发，储存1d后具有61.9%的萌发率，10d后具有53.6%的萌发率，20d后有39.7%的萌发率，30d后萌发率仍能达到26.1%，由此可见，选择含水量20%~15%的花粉在-20℃下储存，能使花粉活力保持30天以上。

表2不同储存温度下甘蔗花粉离体萌发率

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实验验证例：甘蔗花粉收集储存方法

1.供试材料

2015年和2016年春季，以海南甘蔗育种场内种植的roc22作为研究花粉活力材料；以雄性不育系云蔗99-601作为杂交母本材料。待实验材料花穗抽到小笔管大小时，采用高压包茎法诱导茎节根系生长，在甘蔗茎中段三个茎节间均匀涂上一层1cm厚的湿润营养土，用白色塑料布包紧扎实，防止营养土水分蒸发过快。12月上旬起，傍晚将次日开花长势一致的抽穗茎砍下，带回温室内，用清水养茎，为防止串粉每一株单独放在用布隔开的杂交单元格内。

2．花粉采集

早晨7:30开始观察螽花开放时间，及时收集roc22花粉，花粉倒入40目～50目不锈钢筛，过筛后分装入2ml离心管。

3．花粉储存

①将离心管中新鲜花粉平铺一层在干燥滤纸上，厚度保持在0.6mm以内，再加盖一层干燥滤纸，放入培养皿中，用密封膜包封后放在4℃冷藏箱中避光储存24h；

②将离心管中新鲜花粉和变色硅胶按质量比1:7～1:8充分混合后装入2ml冻存管中，在4℃冷藏室下静置8～12min，使花粉含水量降到30%~25%；之后用镊子夹出硅胶颗粒密封后放入0℃冰箱中储存5天。

③将离心管中新鲜花粉和变色硅胶按质量比1:4～1:5充分混合后装入2ml冻存管中，在4℃冷藏室下静置15～18min，使花粉含水量降到20%～15%；之后用镊子夹出硅胶颗粒密封后放在-20℃冰箱中储存30天。

4．花粉活力测定

4.1原位花粉萌发检测

早晨8:00选取新开放的雄性不育系云蔗99-601（提前一天已经将花穗在50℃下5min做杀雄处理）新鲜柱头120个，分别授予三种方式储存的花粉各30个，其中以未授粉柱头作为对照，-20℃下花粉需要在4℃下复水处理30min后再使用。

花粉萌发检测方法①固定：授粉4h后将上述杂交柱头连同子房将外部颖壳去除后，分别放在faa溶液中固定（50%乙醇89ml、冰乙酸6ml和甲醛溶液5ml混合），固定时间需在24h以上。②水洗：将在faa溶液中固定的材料先用纯净水预洗三次，每次2min。③软化透明：将上述水洗过的材料先用8mol/lnaoh软化透明处理2h，之后水洗三次，每次2min。④染色：用0.1%的苯胺蓝（用0.1mol/l的k3po4配制）染色处理12h以上。⑤镜检：镜检时将处理好的甘蔗子房与柱头置于载玻片上，滴加一滴磷酸缓冲液(0.2m，ph6.8，nah2po4和na2hpo4或kh2po4和k2hpo4)盖上盖玻片后用镊子轻压。利用荧光显微镜将载玻片在近紫外光下镜检并照相，使用315～380nm之间的波长。本实验，每一个处理观察10个柱头，以确保实验准确性。

4.2杂交授粉测定花粉生活力

将3种不同方式储存的花粉分别授予雄性不育系粤糖94-128（提前一天已经将花穗在50℃下5min做杀雄处理）每处理3穗，连续授粉3天，以自交为对照，之后将未开花授粉的小穗剪掉，套袋转移到阳光下，水培条件下等待成熟，待种子成熟后，按常规播种20天后统计出苗率。

5结果分析

5.1原位花粉萌发检测

甘蔗柱头表面分泌物具有较大粘性，甘蔗贮存花粉无论是否有活力，开始都会大量附着于柱头表面，具有活力花粉在粘性分泌物诱导下会逐渐萌发，花粉管慢慢伸长，插入柱头内向子房底部慢慢延伸，未有萌发花粉在清水冲洗柱头过程中流失，通过观察柱头花粉粘附及花粉管伸长情况，即可判断储存花粉活力。从图1看出，甘蔗储存花粉授粉4h后都有萌发，说明储存后花粉都有不同程度的活力；反观自交柱头表面未看到花粉，说明本试验选择的云蔗99-601确为雄性不育或花粉发育不良，可极大提高本试验的准确性。从单个柱头附着花粉数量来看，4℃下储存24h花粉﹥0℃下储存5d花粉﹥-20℃下储存30d花粉；花粉管伸长长度上4℃下储存24h花粉和0℃下储存5d花粉在授粉4h后都已经延伸到花粉管底部子房附近，而-20℃下储存30d花粉花粉管仅延伸到柱头的2/3处，花粉管生长速度低于上两个储存的花粉。结果表明，甘蔗花粉经过三种不同的储存方式都能达到延长花粉活力的目的，但随着储存时间延长，不但有活力的花粉数量减少且花粉的活力强度也在降低。

5.2杂交授粉测定花粉生活力

2015~2016年杂交季节共完成12个组合储存花粉的人工授粉杂交试验，其中3个组合为母本自交对照组合，在9个人工授粉组合中全部获得实生苗。云蔗99-601自交对照3个重复组合中，仅组合1出苗数目稍多，其余重复出苗数极少都在10株以下，说明本试验中利用温水杀雄效果较理想。以云蔗99-601为母本，4℃下储存24h的roc22花粉授粉的杂交组合3个重复出苗数都达到1000株以上，说明储存的花粉活力极好；0℃下储存5d授粉的三个杂交组合花穗出苗率也都达到600株以上，其中一个重复出苗率高达962株，说明储存效果也挺好；而-20℃下储存30d花粉与云蔗99-601杂交的三个重复组合中，出苗率也高达300株以上，远远高于对照组合，可见roc22花粉储存30d后仍有一部分花粉可正常授粉结实。

综上所述，本发明的二种甘蔗花粉低温储存技术是延长甘蔗花粉活力行之有效的方法，通过人工授粉可获得较多的杂交后代，打破花期不育的时空限制，提高甘蔗杂交育种效率。

表3储存花粉授粉结实统计

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