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茄子花青素合成相关基因及其编码蛋白.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-06-17 16:30

1、10申请公布号CN104059926A43申请公布日20140924CN104059926A21申请号201410289033222申请日20140624C12N15/29200601C07K14/41520060171申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号72发明人陈火英刘新宇张国刚葛海燕韩洪强周腾夏高莉洁蒋明敏74专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司31236代理人牛山陈少凌54发明名称茄子花青素合成相关基因及其编码蛋白57摘要本发明涉及一种生物技术领域的茄子花青素合成相关基因及其编码蛋白，所述基因为SMTTG1基因、或SMGL3基因、或SMTT8基因；所述SMT

2、TG1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；所述SMGL3基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO4所示；所述SMTT8基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO6所示。利用本发明的茄子SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因，可筛选出受其调控的与花青素合成密切相关的下游基因，以及与其相互作用的其他转录因子基因，从而探究茄子花青素合成路径调控机制。利用茄子SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因也可以通过对基因进行位点突变，改变茄子中的基因序列，从而对茄子果实性状进行改变，达到提高其观赏价值和产量，实现更高的经济价值。51INTCL权利要求书1页说明书17页序列表11页附图2页19中华人民共和国国

3、家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书17页序列表11页附图2页10申请公布号CN104059926ACN104059926A1/1页21一种茄子花青素合成相关基因，其特征在于，所述基因为SMTTG1基因、或SMGL3基因、或SMTT8基因；所述SMTTG1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；所述SMGL3基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO4所示；所述SMTT8基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO6所示。2如权利要求1所述的茄子花青素合成相关基因，其特征在于，所述SMTTG1基因的序列如SEQIDNO1所示。3如权利要求1所述的茄子花青素合成相关基因，其特征在于，所述SMG

4、L3基因的序列如SEQIDNO3所示。4如权利要求1所述的茄子花青素合成相关基因，其特征在于，所述SMTT8基因的序列如SEQIDNO5所示。权利要求书CN104059926A1/17页3茄子花青素合成相关基因及其编码蛋白技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及一种茄子花青素合成相关基因及其编码蛋白。背景技术0002花青素是一类重要的水溶性天然植物色素，属于类黄酮物质，广泛存在于植物表皮细胞的液泡中、呈现橙色、红色至蓝色。花青素根据其基本结构分类很多，其中以矢车菊色素、天竺葵色素以及花翠素这三种最为普通。花青素是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有抗氧化衰老、预防心血管疾病、抗肿

5、瘤、抗突变、调节免疫活性功能；此外，花青素还是一种安全、无毒的天然食用色素。花青素在园艺、食品、保健品等方面具有广泛的应用，对人类健康具有巨大的潜在价值，因此花青素一直是研究的热点领域。0003植物中的花青素生物合成由两类基因的共同控制，一类是结构基因，编码花青素苷生物合成途径中的关键酶；另一类是调控基因，调控花青素苷生物合成基因的表达强度和模式，并且控制花青素苷在时空表达的变化。目前已分离和鉴定了三类花青素合成的转录因子R2R3MYB蛋白、MYC家族的BHLH蛋白和WD40蛋白。这些转录因子通过与结构基因启动子中相应的顺式作用元件结合，从而调节花色素苷生物合成途径中基因的表达。在这个过程中一

6、般是由MYB转录因子、BHLH转录因子和WD40转录因子构成一个蛋白复合体简称MBW蛋白复合体，直接调控结构基因转录的。0004目前，已经从拟南芥、矮牵牛、紫苏、玉米、葡萄、金鱼草、苹果等植物中分离克隆了大量与花青素生物合成代谢相关的结构基因和调控基因，但是在这方面对茄子的研究鲜少有报道。本研究中分离克隆了茄子花青素合成相关的WD40转录因子基因SMTTG1,BHLH转录因子基因SMGL3和SMTT8，研究了它们在茄子不同组织的表达特异性，并且利用酵母双杂交系统，检测这几个翻译的蛋白与MYB转录因子基因SMMYB形成的蛋白两两之间的互作情况，为进一步探究茄子花青素生物合成调控机制提供基础。经对

7、现有技术文献的检索，尚未发现与本发明相同或者相似的技术主题。发明内容0005本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种茄子花青素合成相关基因及其编码蛋白。本发明针对目前对茄子研究基础薄弱的现状，克隆出茄子花青素合成相关转录因子SMTTG1,SMGL3,SMTT8的基因序列，进而可通过对该基因表达的调控及干扰等操作，提高茄子的品质。0006本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种茄子花青素合成相关基因，所述基因为SMTTG1基因、或SMGL3基因、或SMTT8基因；0007所述SMTTG1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；0008所述SMGL3基因编码的氨基酸序列如SEQID

8、NO4所示；0009所述SMTT8基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO6所示。说明书CN104059926A2/17页40010优选地，所述SMTTG1基因的序列如SEQIDNO1所示。0011优选地，所述SMGL3基因的序列如SEQIDNO3所示。0012优选地，所述SMTT8基因的序列如SEQIDNO5所示。0013本发明根据GENEBANK数据库，运用生物信息学手段，通过同源序列比较设计出简并引物，用分子克隆的方法，克隆出紫色茄子中SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因；经过序列分析，确定是茄子的相关基因；组织表达分析发现，SMTTG1,SMGL3和SMTT8基因各组织荧光半定量检测值

9、，结果显示，三个基因在根、茎、也、花、果皮、果肉中均有表达，但在不同组织中表达量不同。SMTTG1基因在叶片中表达水平最高，显著高于其他各组织；在其他组织中表达量相当，无显著性差异。SMGL3基因在茎中表达量最高显著高于其他各组织，其次是花和果肉，在根和叶中表达量很低。SMTT8在果皮中的表达量最高，在茎中也有显著表达，在根、叶、花、果肉中表达量低，且无显著性差异。0014本发明具有如下有益效果本发明的SMTTG1,SMGL3,SMTT8都是转录因子基因为茄子花青素合成的关键调控基因，该基因通过结合顺式元件调节下游基因的表达，从而调控花青素合成。利用本发明的茄子SMTTG1,SMGL3,SMT

10、T8基因，可筛选出受其调控的与花青素合成密切相关的下游基因，以及与其相互作用的其他转录因子基因，从而探究茄子花青素合成路径调控机制。利用茄子SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因也可以通过对基因进行位点突变，改变茄子中的基因序列，从而对茄子果实性状进行改变，达到提高其观赏价值和产量，实现更高的经济价值。附图说明0015通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显0016图1为本发明的SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因的CDNA琼脂糖凝胶电泳图；0017图2为本发明基因SMTTG1组织表达分析图；0018图3为本发明基因SMGL3组织表达

11、分析图；0019图4为本发明基因SMTT8组织表达分析图；0020图5为本发明SMTTG1,SMGL3,SMTT8与SMMYB蛋白之间的酵母双杂交验证图。具体实施方式0021下面结合具体的实施例和附图，进一步阐述本发明的具体实施方式。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等1989编著的分子克隆克隆实验手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0022本发明涉及的RNA提取、PCR纯化、质粒回收等试剂盒通过公

12、开市售的商业渠道获得，够买于生工生物上海股份有限公司，大肠杆菌ESCHERICHIACOLI菌株DH5由本实验室保存，TAQDNA聚合酶、限制性核酸内切酶、AMV反转录酶、凝胶回收试剂盒及合成引物购自生工生物公司，MAXDNA高保真酶、PMD19T载体、RACE扩增试剂盒购自大连宝生物公司TAKARA。说明书CN104059926A3/17页50023图1为本发明的SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因的CDNA琼脂糖凝胶电泳图；SMTTG1基因片段A、SMGL3基因片段、BSMTT8基因片段C和SMMYB基因片段D；图2为本发明基因SMTTG1组织表达分析图；图3为本发明基因SMGL3组织

13、表达分析图；图4为本发明基因SMTT8组织表达分析图；图5为本发明SMTTG1,SMGL3,SMTT8与SMMYB蛋白之间的酵母双杂交验证图。0024实施例1、茄子花青素合成相关SMTTG1,SMGL3,SMTT8的克隆及组织表达特性分析0025本实施例涉及茄子花青素合成相关SMTTG1,SMGL3,SMTT8的克隆及组织表达特性分析，包括如下步骤0026步骤一，茄子花青素合成相关SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因的克隆00271、茄子实验材料取材0028本实验所用的植物材料为本课题组保存的茄子优良种质资源YZ14邵文婷,刘杨，韩洪强2013茄子花青素合成相关基因SMMYB的克隆与功能研

14、究园艺学报403467478，YZ14表型为无刺，紫茎，紫花，紫色果实。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。取紫茄的根、紫色茎、紫色叶片、紫色花瓣、紫色果实。00292、TRIZOL法提取商品成熟期紫色果皮中的总RNA；00301称取05G紫长茄的商品成熟期紫色果皮，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，分装于15ML的EPPENDORF离心管中；00312加入1MLTRIZOL，用力摇动使混合均匀,25，放置5MIN；00323每管加02ML氯仿,用力振荡15SEC,室温放置2MIN3MIN,4,12,000G,离心15MIN；00334将上清

15、液600UL吸入15ML的新EPPENDORF离心管中,加与上清等体积异丙醇,颠倒混匀，20冰箱中放置30MIN；003454,12,000G,离心15MIN，弃上清,收集RNA沉淀，加1ML75V/V乙醇洗涤沉淀12次，洗涤具体为加1ML75V/V乙醇，4离心,12000G,10MIN15MIN，弃上清,收集RNA沉淀；00356沉淀25下干燥15MIN20MIN，溶于30L50L的RNASEFREEWATER中；00367用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。00373、SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因CDNA全长的克隆与SMMYB基因的扩增0038根

16、据拟南芥中与花青素合成相关的基因TTG1，GL3,TT8的序列信息，在NCBI中进行BLAST比对后，挑选其中与茄子亲缘关系近的植物的同源蛋白序列，并获得其相应的编码序列CDS，针对两端的保守区设计能够扩增出全长的简并引物表7并以茄子CDNA为模板，采用LA酶扩增中间序列，产物纯化后连接到T载体上，经多次测序，得到完整的编码序列。参照邵文婷等设计特异引物表1，扩增得到SMMYB编码序列。PCR反应条件为944MIN；9430S,5545S,721MIN或2MIN,32个循环；728MIN。0039将测序得到的核苷酸序列用NCBI的BLASTN方法与GENBANK中已登陆的TTG1,GL3和TT

17、8基因序列进行比对，结果表明SMTTG1与马铃薯TTG1基因序列同源性达到94，番茄TTG1基因同源性为92,SMGL3与马铃薯GL3基因序列同源性达到94，番茄GL3基因同源性为93,SMTT8与马铃薯GL3基因序列同源性达到85，番茄GL3基因同源性为83。说明书CN104059926A4/17页6特异引物扩增得到的片段大小与SMMYB的大小一致。0040表1茄子和马铃薯TTG1基因核苷酸的序列比对00410042说明书CN104059926A5/17页70043说明书CN104059926A6/17页80044POTATO马铃薯TTG1基因核苷酸序列NCBI登录号为XM_00634745

18、80045EGGPLANT茄子TTG1基因核苷酸序列0046表2茄子和马铃薯TTG1基因编码的氨基酸序列比对00470048POTATO马铃薯TTG1基因编码氨基酸序列NCBI登录号XP_0063475190049EGGPLANT茄子TTG1基因编码氨基酸序列0050表3茄子和马铃薯GL3基因核苷酸的序列比对00510052说明书CN104059926A7/17页90053说明书CN104059926A8/17页100054说明书CN104059926A109/17页110055POTATO马铃薯GL3基因核苷酸序列NCBI登录号为XM_0063439150056EGGPLANT茄子GL3基因

19、核苷酸序列0057表4茄子和马铃薯GL3基因编码的氨基酸序列比对0058说明书CN104059926A1110/17页1200590060POTATO马铃薯GL3基因编码氨基酸序列NCBI登录号NP_0012751320061EGGPLANT茄子GL3基因编码氨基酸序列0062表5茄子和马铃薯TT8基因核苷酸的序列比对0063说明书CN104059926A1211/17页1300640065说明书CN104059926A1312/17页140066说明书CN104059926A1413/17页150067POTATO马铃薯TT8基因核苷酸序列NCBI登录号为NM_0012881690068EG

20、GPLANT茄子TT8基因核苷酸序0069表6茄子和马铃薯TT8基因编码的氨基酸序列比对0070说明书CN104059926A1514/17页1600710072POTATO马铃薯TT8基因编码氨基酸序列NCBI登录号NP_0012750980073EGGPLANT茄子TT8基因编码氨基酸序列0074步骤二，茄子SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因组织表达分析；0075分别取等量已进行浓度和质量检测的茄子的根、茎、叶、花、果皮和果肉，RNA反转录成CDNA后稀释成引物工作的最佳倍数，按照TAKARA试剂盒PREMIXEXTAGTMTLIRNASEHPLUS步骤进行荧光半定量PCR反应。以茄

21、子ACTIN作为内参，设计特异引物SMACTIONF和SMACTIONR附表1，对茄子各器官进行荧光半定量PCR检测。利用FUNGLYN公司FTC3000型荧光定量PCR仪进行反应，程序如下00760077说明书CN104059926A1615/17页170078荧光定量PCR设置在STAGE2的STEP2进行信号采集。定量PCR的方法采用相对定量法，通过与内参基因ACTIN的CT值之差计算基因表达差异，即2CT法定量。定量PCR引物序列见表7。结果显示，三个基因在根、茎、也、花、果皮、果肉中均有表达，但在不同组织中表达量不同。SMTTG1基因在叶片中表达水平最高，显著高于其他各组织；在其他组

22、织中表达量相当，无显著性差异。SMGL3基因在茎中表达量最高显著高于其他各组织，其次是花和果肉，在根和叶中表达量很低。SMTT8在果皮中的表达量最高，在茎中也有显著表达，在根、叶、花、果肉中表达量低，且无显著性差异。0079表7定量PCR引物序列00800081说明书CN104059926A1716/17页180082实施例2、茄子花青素合成相关SMTTG1,SMGL3,SMTT8蛋白与SMMYB蛋白之间相互作用0083本实施例涉及茄子花青素合成相关SMTTG1,SMGL3,SMTT8蛋白与SMMYB蛋白之间相互作用，包括如下步骤0084步骤一，酵母双杂交重组表达载体的构建0085分别设计特异

23、引物扩增基因表7，用ECORI和SALI对扩增产物SMTTG1,SMGL3,SMTT8与SMMYB和酵母表达质粒PGBKT7进行双酶切；用ECORI和XHOI对扩增产物SMTTG1,SMGL3,SMTT8与SMMYB和酵母表达载体PGADT7进行双酶切；四个基因片段分别与PGBKT7连接，转化ECOLIDH5感受态细胞，涂于LB平板上含KANA抗性；四个基因片段再分别与PGAKT7连接，转化ECOLIDH5感受态细胞，涂于LB平板上含AMP抗性。37培养过夜，筛选阳性重组子，并进行菌液PCR和酶切鉴定，将含有插入目的片段的阳性克隆送生工生物公司进行测序，鉴定插入片段是否与目的基因一致。序列正确

24、的重组质粒分别命名为PGBKT7SMTTG1、PGBKT7SMGL3、PGBKT7SMTT8、PGADT7SMTTG1、PGADT7SMTT8和PGADT7SMMYB。0086以茄子的CDNA为模板，用合成的引物扩增相应片段，经1琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小与引物的理论扩增值大小相符。提取筛选的阳性克隆质粒DNA，分别经ECORI与SALI双酶切，ECORI与XHOI双酶切，电泳后初步表明载体构建正确。经公司测序比对，与目的基因序列完全一致，进一步证明载体构建成功。0087步骤二，酵母细胞的转化008880储存的酵母菌株AH109，在含有2葡萄糖的YPD固体平板上划线，30培养23天。挑取

25、单菌落于5ML含有2葡萄糖的YPD液体培养基中，30220RPM培养24小时。将100L菌液转接到50ML含有20葡萄糖的YPD液体培养基中，30220RPM培养24小时。取15ML菌液12000RPM离心1分钟，弃上清后加入100L一步转化缓冲液重悬菌体，加入BAIT、PREY、REPORTERPSH1834载体和CARRIERDNA各100NG，充分混匀。45水浴30分钟后涂板于SDTRPLEU培养基,30培养大约3天。0089步骤三，酵母双杂交检测SMTTG1,SMGL3,SMTT8与SMMYB蛋白之间的相互作用0090将重组质粒PGBKT7SMTTG1/PGADT7SMMYB、PGBK

26、T7SMGL3/PGADT7SMMYB、PGBKT7SMTT8/PGADT7SMMYB、PGBKT7SMTT8/PGADT7SMTTG1、PGBKT7SMTTG1/PGADT7SMGL3与两个对照组PGBKT7SMTTG1/PGADT7、PGBKT7SMGL3/PGADT7、PGBKT7SMTT8/PGADT7对照组和PGBKT7/PGADT7SMTTG1、PGBKT7/PGADT7SMTT8和PGBKT7/PGADT7SMMYB对照组分别共转化到AH109感受态细胞，转化方法如上。转化产物分别涂布于SDTRPLEU培养基，于30倒置培养34天，观察菌落生长情况，用无菌牙签挑取说明书CN104

27、059926A1817/17页19平板上生长的菌落转接于SDTRPLEU/HIS和SDTRPLEU/HISADE培养基上，观察其是否互作。0091重组质粒的共转化产物与对照的共转化产物都能在SDTRPLEU培养基上正常生长附图4，第1列，但是在SDTRPLEU/HISADE培养基上只有重组质粒组PGBKT7SMTTG1/PGADT7SMMYB、PGBKT7SMGL3/PGADT7SMMYB、PGBKT7SMTT8/PGADT7SMMYB、PGBKT7SMTT8/PGADT7SMTTG1、PGBKT7SMTTG1/PGADT7SMGL3能长出菌落附图4，第4、5列，对照诱饵BAIT组PGBKT7

28、SMTTG1/PGADT7、PGBKT7SMGL3/PGADT7、PGBKT7SMTT8/PGADT7附图4，第2列和对照猎物PREY组PGBKT7/PGADT7SMTTG1、PGBKT7/PGADT7SMTT8和PGBKT7/PGADT7SMMYB都没有生长图4，第3列。0092酵母双杂交实验结果表明，SMMYB分别与SMTTG1,SMGL3,SMTT8之间存在相互作用，且SMTTG1与SMTT8，SMGL3之间也存在着相互作用。所有的共转化产物都能在二缺的平板上正常生长且长势很好，同时诱饵组PGBKT7SMTTG1、PGBKT7SMGL3、PGBKT7SMTT8都不存在自激活反应，猎物组P

29、GADT7SMTTG1、PGADT7SMTT8和PGADT7SMMYB也都不存在自激活反应。0093可见，利用本发明的茄子SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因，可筛选出受其调控的与花青素合成密切相关的下游基因，以及与其相互作用的其他转录因子基因，从而探究茄子花青素合成路径调控机制。利用茄子SMTTG1,SMGL3,SMTT8基因也可以通过对基因进行位点突变，改变茄子中的基因序列，从而对茄子果实性状进行改变，达到提高其观赏价值和产量，实现更高的经济价值。0094本发明根据茄科模式植物马铃薯、番茄、矮牵牛和烟草的TTG1,GL3,TT8相关的基因序列，采用同源克隆的方式获得了茄子的SMTTG1

30、,SMGL3,SMTT8的基因。SMTTG1基因的CDNA全长1220BP，基因编码区长1029BP，没有内含子，编码342个氨基酸；SMGL3基因的CDNA全长2329BP，基因编码区长1887BP，编码628个氨基酸；SMTT8基因的CDNA全长2242BP，基因编码区长1896BP，编码631个氨基酸。0095本发明为生物技术领域三种茄子花青素合成相关TTG1,GL3和TT8基因序列。利用同源克隆的方法获得该基因全长序列，TTG1具有SEQIDNO1中从核苷酸第11029位所示的核苷酸序列,GL3具有SEQIDNO3中从核苷酸第11887位所示的核苷酸序列,TT8具有SEQIDNO5中从

31、核苷酸第11896位所示的核苷酸序列。利用生物信息学软件对其序列分析，确定SEQIDNO1序列具有典型的WD结构域，确定为WD40家族基因，SEQIDNO3和SEQIDNO5序列都具有典型的HLH结构域，确定它们为BHLH家族基因。酵母双杂交分析表明，茄子中的SMMYB分别与SMTTG1,SMGL3,SMTT8发生相互作用，且SMTTG1与SMTT8，SMGL3之间也存在着相互作用。0096以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。说明书CN104059926A191/

32、11页2000010002序列表CN104059926A202/11页210003序列表CN104059926A213/11页220004序列表CN104059926A224/11页230005序列表CN104059926A235/11页240006序列表CN104059926A246/11页250007序列表CN104059926A257/11页260008序列表CN104059926A268/11页270009序列表CN104059926A279/11页280010序列表CN104059926A2810/11页290011序列表CN104059926A2911/11页30序列表CN104059926A301/2页31图1图2图3说明书附图CN104059926A312/2页32图4图5说明书附图CN104059926A32