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GhMPK9基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用

来源：花匠小妙招时间：2025-06-17 15:30

本发明属于生物技术应用领域，涉及棉花ghmpk9基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用，该基因编码一个丝裂原活化蛋白激酶。通过对棉花mapk家族的鉴定与分析，在陆地棉遗传标准系tm-1中一共鉴定到28个mapk基因，筛选到一个抗黄萎病关键基因ghmpk9，进一步进行基因全长序列克隆及互作验证，结合转基因验证及分子机理解析，确定ghmpk9在棉花抗黄萎病中的功能，挖掘了ghmpk9下游的关键抗病基因ghraf39_1和ghwrky40a，发现ghraf39_1在介导ghmpk9磷酸化ghwrky40a调控棉花黄萎病抗性中发挥重要作用。棉花中ghmpk9基因保守，在四倍体棉花中存在2个拷贝，a、d亚组各一个。ghmpk9在棉花根、茎和花器官中有较高表达，受黄萎病菌诱导显著上调表达并且在12小时表达水平最高。利用pcr技术在陆地棉中获得ghmpk9基因a亚组的全长orf序列及编码的氨基酸序列。利用生物技术对该基因参与的植物抗病性以及功能机制进行了具体的研究，ghmpk9是棉花生长发育关键基因，在棉花中敲除该基因影响植株雄蕊、雌蕊的发育，显著干扰植株的生殖发育，不能结铃继代。将该基因在棉花中过量表达激活棉花的免疫反应，显著提高植株抗病性。

背景技术：

1、黄萎病菌为一种土传的半活体营养型真菌，其可以侵染200多种双子叶植物，其中包括棉花、番茄、黄瓜、辣椒、茄子和马铃薯等主要的经济作物，具有寄主范围广泛、传播速度快及土壤中存活时间久等特点，在田间难以防治(bhat and subbarao,1999)。黄萎病菌的生活周期从微菌核的萌发开始，当感知到植物根部所释放的分泌物为信号后，微菌核开始产生胚芽管，并沿根表皮细胞纵向延伸。其中少量的菌丝顶端膨胀肿大，以附着枝的形式紧紧吸附在根表面，形成狭小的侵染钉结构穿透表皮进行侵染；在侵染的过程中，病原菌将分泌一些胶状物使其附着枝牢牢固定在侵染界面，用以承受穿透瞬间所产生的后座力；同时释放大量的细胞壁水解酶，如果胶酶、角质酶及纤维素酶等，破坏植物细胞壁组织(sesmaand osbourn,2004；zhao et al.,2014；zhao et al.,2016)；大量效应因子破坏或干扰植物的免疫反应(de jonge et al.,2011)。成功侵入后的菌丝逐渐向中心位置蔓延，最终进入木质部并定殖，在细胞内或细胞间生长繁殖，并顺着木质部导管向上扩展至茎部或叶部(shaban et al.,2018)。棉花是世界上最主要的农作物之一，它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的粮食作物，具有显著的综合利用价值。近年来，由于气候条件的变化、长期单作的种植模式和频繁引入的棉花新品种，黄萎病成为我国高产优质棉花生产中的主要障碍之一。黄萎病是棉花“第一大病害”，传播途径广泛，棉籽、病株残体、土壤、肥水、农具等多种媒介都可传播，此病危害严重，轻者叶片失绿变黄，蕾铃脱落严重减产，重者整株成片死亡，绝产绝收。针对黄萎病害化学防治策略并不理想，田间轮作等管理手段也只能适当缓解病害的发生，挖掘棉花中关键抗病基因并创制抗病材料是提高抗病性最直接和有效的策略。

2、植物与病原菌相互斗争及协同进化过程中，也表现出各种抵御病菌的方式和能力。在过去的十年中，研究者们对植株抵抗大丽轮枝菌引起的维管束病害的生理和分子机制进行了一系列研究。目前已发现植物可以通过多种调控机制对黄萎病菌产生抗性，包括细胞壁修饰、胞外酶反应、模式识别受体响应、免疫信号转导和与植物激素水平调节等(song et al.,2020)。首先，植株的物理机械屏障和化学防御很关键，包括细胞壁结构性修饰及抗毒物质的合成等(ahuja et al.,2012)。同时，植株具备pti和eti两套复杂且精密的防御系统，即植物免疫锯齿模型(jones and dangl,2006)。当植物受到病原菌攻击后，细胞表面的受体感知到病原相关分子模式触发pti免疫反应，包括诱导活性氧爆发、激素信号响应及抗性相关基因激活等；为了抑制病原菌释放的各种效应蛋白，植物能够分泌抗病的r蛋白进一步识别效应蛋白触发eti过程，反应通常伴随局部组织的细胞程序性坏死，阻止病原菌在细胞间传播感染，最终建立整株植物的系统获得性抗性(zipfel,2008)。同时，pti和eti过程具有潜在的复杂协作机制，受体和r蛋白能协同作用并激活植物的免疫相关通路(bruno et al.,2021；yuan et al.,2021)。在棉花中已经功能表征了很多抗病相关基因，广泛涉及细胞壁修饰、次级代谢改变、免疫受体识别及与效应蛋白的互作机理，其中丝裂原活化蛋白激酶(mapk)级联介导的免疫信号传递过程位于这个系统的中枢，负责接收上游模式识别受体的信号并通过磷酸化不同的底物将免疫信号级联放大，进而引发细胞免疫反应。

3、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)级联途径是植物进化中保守的信号转导模块，主要通过磷酸化的方式将细胞外信号转导到细胞核内来进行适当的细胞调节(meng and zhang,2013)。mapk级联途径涉及三种激酶：丝裂原活化蛋白激酶(mapks)、mapk激酶(mkks)和mapk激酶激酶(mapkkks)，它们在生物和非生物胁迫中都具有重要的作用(shi et al.,2011)。mapks位于细胞质和细胞核中，参与各种细胞过程，如生长、发育和多重胁迫响应等(danquah et al.,2015；wang et al.,2015)。mapk基因在植物中的进化高度保守，不同植物的mapk基因可以基于序列相似性和激酶亚结构域vii和viii之间的标志性txy基序特征来进行鉴定(hamel et al.,2006)。目前拟南芥中已鉴定到20个mapk基因(ichimura etal.,2002)，水稻中有17个mapk基因(wankhede et al.,2013)，黄瓜中有14个mapk基因(wang et al.,2015)，番茄中有16个mapk基因(kong et al.,2012)，玉米中有15个mapk基因(kong et al.,2013)，油菜中有20个mapk基因(sun et al.,2014)，二穗短柄草中有16个mapk基因(min et al.,2014)，西瓜中有15个mapk基因(song et al.,2015)，葡萄中有14个mapk基因(et al.,2015)，苹果中有26个mapk基因(shizhong et al.,2013)，香蕉中有22个mapk基因(asif et al.,2013)，大豆中有38个mapk基因(neupane et al.,2013)，烟草中有17个mapk基因(xing et al.,2013)。

4、根据txy基序中间位置的氨基酸，植物mapk可分为两个亚型，即与酵母和动物erk亚家族相关的tey亚型和植物特异性的tdy亚型。其中，植物mapk的tey亚型可以进一步分为三组：以拟南芥mpk3和mpk6为代表的a组，最初与植物免疫和对非生物胁迫的反应有关，后来表明在植物生长和发育中也发挥重要作用(xu and zhang et al.,2015；zhang et al.,2018)。烟草ntsipk和ntwipk可被多种生物和非生物胁迫所诱导，参与植物过敏性反应和细胞死亡；水稻osmpk5被不同的病原菌以及环境刺激所诱导(soyano et al.,2003；agrawalet al.,2002；xiong et al.,2003)。b组包括拟南芥mpk4、mpk5、mpk11、mpk12和mpk13，这些基因也参与植物免疫、对环境变化的响应和生长发育(de zelicourt et al.，2016；thulasi devendrakumar et al.，2018)。烟草ntntf6也参与了广泛的信号传递过程，包括各种生物、非生物胁迫反应和细胞分裂活动等。c组包括拟南芥mpk1、mpk2、mpk7和mpk14，其中atmpk1、atmpk2受机械损伤、ja、aba以及h2o2诱导(ren et al.,2002；ouaked et al.,2003)。水稻osmpk4受机械损伤、ja、sa、aba、et、h2o2、盐胁迫、蔗糖及重金属诱导表达。植物mapk的tdy亚型也称为d组mapk，在拟南芥中有八个成员，包括mpk8、mpk9、mpk15、mpk16、mpk17、mpk18、mpk19和mpk20。相较于a、b和c组成员，d组成员具有可扩展的c端区域。有研究指出拟南芥mpk9在其tdy基序的thr和tyr残基上存在自磷酸化，其激活不需要上游mapkk(nagy et al.,2015)。mpk9还可与b亚组中的mpk12一起参与拟南芥保卫细胞中ros介导的aba信号途径(jammes et al.,2009)。此外，水稻中d组成员osbwmk1、osmpk13、osmpk15、osmpk17等都受到病原菌，sa以及et诱导表达(soyano et al.,2003；agrawal et al.,2002)。

5、棉花黄萎病是棉花“第一大病害”，传播途径广泛，棉籽、病株残体、土壤、肥水、农具等多种媒介都可传播。其中mapk级联途径介导的免疫信号通路在调控棉花对黄萎病的抗性方面发挥了关键作用。目前在陆地棉中，鉴定到52个mapk、23个mapkk、166个mapkkk，在雷蒙德氏棉中鉴定到28个候选mapk级联基因(zhang et al.,2014；yin et al.,2021)。wang从陆地棉中首次分离克隆了一个棉花c组mapk基因ghmpk2，在烟草中过表达ghmpk2，其通过调控植物ros和et信号路径增强了植株对烟草花叶病毒，枯萎病等病毒的抗性(wang etal.,2007)。zhang从陆地棉中分别分离了a亚组ghmkk1和c亚组ghmkk4和ghmkk5，在烟草中过表达ghmkk5后提高了植株对逆境胁迫与病原菌侵染的耐性(zhang et al.,2012)。shi从陆地棉中分离到两个mapk基因ghmpk7和ghmpk16，ghmpk7参与调控植物的生长发育和sa介导的植物广谱抗性；在拟南芥中过表达ghmpk16增强了其对青枯假单胞菌的抗性(shi etal.,2010；2011)。mapk级联途径中的mkk成员在精细调控棉花对黄萎病的抗性方面则发挥出双重作用：ghmkk4、ghmkk6和ghmkk9正调控棉花黄萎病抗性，而ghmkk10负调控棉花黄萎病抗性(meng et al.,2018)。使用基因沉默技术，ghndr1和ghmkk2被证明对棉花的黄萎病抗性至关重要(gao et al.,2011)。ghmkk4-ghmpk20-ghwrky40级联途径负调控棉花对枯萎病的抗性(wang et al.,2018)。过表达ghmkk6-ghmpk4级联的支架蛋白ghmorg1增强棉花对枯萎病的抗性(wang et al.,2019)。ghmkk2-ghntf6-ghmyc2级联途径通过上调类黄酮生物合成相关基因的表达增加对枯萎病的抗性(wang et al.,2022)。随着对植物mapk研究的深入，越来越多的mapk磷酸化底物被发现，为深入理解mapk信号传导在植物免疫中的作用机制奠定基础。ghmkk4、ghmkk6和ghmkk9正调控棉花黄萎病抗性，而ghmkk10负调控棉花黄萎病抗性(meng et al.,2018)。使用基因沉默技术，ghndr1和ghmkk2被证明对棉花的黄萎病抗性至关重要(gao et al.,2011)。结合mapk分子机制解析，进一步探究棉花不同的mapk级联途径，将是棉花抗病育种研究的重点。

6、本发明在研究中，克隆并鉴定了棉花中的ghmpk9基因，其在棉花根部的诱导下大量表达。并通过全长序列体内和体外的互作验证，明确了ghmpk9下游的关键抗病基因ghraf39_1和ghwrky40a，发现ghraf39_1在介导ghmpk9磷酸化ghwrky40a调控棉花黄萎病抗性中发挥重要作用。本发明研究发现，过量表达ghmpk9提高了棉花对黄萎病菌的抗性。棉花中对ghmpk9的研究较少，其在植物抵御病原菌过程中的功能机制尚缺少系统的研究。通过基因干扰及过量表达的方法获得ghmpk9的转基因植株，明确了ghmpk9在棉花生长发育及抗病性中的重要作用。黄萎病被称为棉花的“癌症”，发掘植物中阻止其致病因子的关键基因，并通过有效的基因工程手段创造抗病种质尤为关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种棉花ghmpk9基因在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。利用转基因的棉花材料证明了过量表达ghmpk9可以显著提高植株对黄萎病的抗性。以此基因为靶基因，通过转基因等基因工程方法，在植株中过量表达ghmpk9基因，培育生长发育正常，棉纤维产量、品质与对照无显著差异，且抗性显著提高的棉花新种质并在生产上应用。

2、本发明的另一目的在于提供一种提高棉花抗黄萎病的方法。

3、本发明的又一目的在于提供一种棉花ghmpk9基因，并提供该基因在陆地棉a亚组(ghmpk9a)中的全长cdna orf核苷酸序列及编码的氨基酸序列。

4、本发明的目的通过以下技术方案实现：

5、第一方面，本发明请求保护如seq id no.1所示的ghmpk9基因在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。

6、第二方面，本发明请求保护含有核苷酸序列如seq id no.1所示的ghmpk9基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。

7、进一步，上述的应用具体是以所述的ghmpk9基因为靶基因，通过基因工程方法，过量表达ghmpk9基因，提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质并在生产上应用。

8、进一步优选的，所述的抗病性为黄萎病抗病性。所述的目标植物为棉花或拟南芥。

9、第三方面，本发明请求保护一种提高棉花抗黄萎病的方法，在棉花中过量表达核苷酸序列如seq id no.1所示的ghmpk9基因。

10、第四方面，本发明请求保护一个能显著提高植物抗病性的ghmpk9基因，该基因在陆地棉的基因组a亚组(ghmpk9a)中，其全长cdna orf的核苷酸序列如seq id no.1所示。

11、第五方面，本发明请求保护由ghmpk9基因编码的蛋白，该蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。

12、第六方面，本发明请求保护含有上述ghmpk9基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

13、研究发现，将所述的ghmpk9a基因过量表达到棉花中能显著提高植株的抗病性，且不影响植株正常生长发育。以所述的ghmpk9基因为靶基因，获得抗病性显著提高的棉花材料，并通过与生产上主推品种进行杂交及回交转育，将目标基因/位点导入现有的推广品种中，对推广品种进行抗病性改良。

14、本发明的优点表现在：

15、(1)对棉花中的ghmpk9基因进行系统的序列结构、表达模式及功能分析，明确ghmpk9在棉花抗病性中的重要作用。

16、我们通过系统的分子生物学实验证实了棉花中ghmpk9表达水平的下降在黄萎病菌侵染后降低了棉花对黄萎病的抗性，在棉花中抑制ghmpk9基因表达影响了植株的生殖发育导致不育的表型无法产生后代。在棉花中过量表达ghmpk9基因对植株的生长发育没有影响，但在黄萎病菌侵染后，其抗病相关的免疫通路被增强，广泛涉及受体的识别、激素信号转导及抗病基因表达。研究结果揭示了棉花中ghmpk9调控植物生殖器官的生长发育及黄萎病抗性的分子机制，也为进一步探究植物如何精准平衡生长-免疫的研究方向提供了新思路与参考。

17、(2)首次挖掘到ghmpk9下游的关键抗病基因ghraf39_1和ghwrky40a，发现ghraf39_1在介导ghmpk9磷酸化ghwrky40a调控棉花黄萎病抗性中发挥重要作用。

18、到目前为止，棉花中鲜有关于mapks抵御黄萎病的相关研究报道尤其少有mapks抵御黄萎病详细分子机制的研究报道。我们通过整合多个组学分析的结果，挖掘与ghmpk9互作的关键抗病基因ghraf39_1和ghwrky40a，借助相关生理生化实验明确ghmpk9、ghraf39_1和ghwrky40a之间的互作和调控关系。通过这些结果能够为分子设计育种或基因工程改良棉花抗病性提供理论指导和遗传资源。